唾液酸化的定量控制的利记博彩app
【专利说明】唾液酸化的定量控制
[0001] 本公开涉及具有N-末端截短缺失的某些糖基转移酶变体的用途。与先前发现相 反，发现某些截短表现出唾液酸酶酶促活性，特别是具有涉及各自野生型多肽的前89个 N-末端氨基酸的截短缺失的人半乳糖苷-α-2,6_唾液酸转移酶I (hST6Gal_I)的变 体。本公开中记录的一个基本发现是，存在该酶的变体，其能够催化糖基部分的转移以及其 水解。因此，公开了哺乳动物糖基转移酶的具体示例性变体，编码其的核酸，用于重组产生 哺乳动物糖基转移酶的变体的方法和方式及其用途，特别是用于以定量受控方式唾液酸化 作为糖蛋白诸如免疫球蛋白的部分的聚糖部分的末端受体基团的用途。
[0002] 背景 转移酶（EC 2)催化官能团从一种物质转移至另一种物质。糖基转移酶，酶的超家族， 参与合成糖蛋白、糖脂和糖胺聚糖的碳水化合物部分。特定糖基转移酶通过将活化的糖供 体的单糖部分的相继转移至受体分子来合成寡糖。因此，"糖基转移酶"催化糖部分从其核 苷酸供体转移至多肽、脂质、糖蛋白或糖脂的受体部分。该过程也被称为"糖基化"。作为例 如糖蛋白的结构部分的碳水化合物部分也被称为"聚糖"。聚糖构成最流行的所有已知的翻 译后蛋白修饰。聚糖参与和粘附、免疫应答、神经细胞迁移和轴突延伸一样多样的广泛系列 的生物识别过程。作为糖蛋白的结构部分，聚糖也在蛋白折叠和蛋白稳定性和生物活性的 支持中具有作用。
[0003] 在糖基转移酶催化中，单糖单元葡萄糖（Glc)、半乳糖（Gal)、N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc)、葡糖醛酸（GlcUA)、半乳糖醛酸（GalUA)和木糖被活 化为尿苷二磷酸（UDP)-a -D衍生物；阿拉伯糖被活化为UDP-β -L衍生物；甘露糖（Man)和 岩藻糖分别被活化为⑶P- ct -D和⑶P- β -L衍生物；且唾液酸（=Neu5Ac; = SA)被活化为 β -D-Neu5Ac 的 CMP 衍生物。
[0004] 许多不同的糖基转移酶有助于聚糖的合成。糖蛋白的碳水化合物部分的结构多样 性特别大，且通过复杂的生物合成途径来确定。在真核生物中，糖蛋白的聚糖-部分的生物 合成发生于内质网（"ER"）和高尔基体的内腔中。糖蛋白的单一（支链或直链）碳水化 合物链通常是N-或0-连接的聚糖。在翻译后加工过程中，碳水化合物通常经由天冬酰胺 ("N-连接的糖基化"），或经由丝氨酸或苏氨酸（"0-连接的糖基化"）连接至多肽。聚糖 的合成，无论N-连接或0-连接（="N-/0-连接的"），受几种不同的膜锚定的糖基转移酶 的活性影响。糖蛋白可以包含一个或多个聚糖连接的氨基酸（="糖基化位点"）。具体聚 糖结构可以是直链或支链的。支链是碳水化合物的显著特点，其与DNA、RNA和多肽典型的 线性性质相反。与它们的基本构建块的大异质性组合，单糖，多糖结构表现出高多样性。此 外，在特定糖蛋白种类的成员中，连接至特定糖基化位点的聚糖的结构可以变化，因此导致 各自糖蛋白种类（即，共享多肽部分的相同氨基酸序列的种类）的微观异质性。
[0005] 唾液酸转移酶（="ST"）是催化唾液酸（=5-N-乙酰神经氨酸=Neu5Ac = NANA) 残基从供体化合物转移至（i )糖脂或神经节苷脂的末端单糖受体基团或（ii)糖蛋白的 N-/0-连接的聚糖的末端单糖受体基团的糖基转移酶。对于哺乳动物唾液酸转移酶，包括 人ST种类，存在作为胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸（=CMP-Neu5Ac = CMP-ΝΑΝΑ)的 共同供体化合物。唾液酸残基的转移也被称为"唾液酸化（sialylating) "和"唾液酸化 (sialylation)，'。
[0006] 在唾液酸化的糖蛋白的聚糖结构中，通常在寡糖的末端位置中发现（一个或多 个）唾液酸部分。由于末端，即暴露位置，唾液酸可以参与许多不同的生物识别现象且服务 于不同种类的生物相互作用。在糖蛋白中，可以存在多于一个唾液酸化位点，即能够充当唾 液酸转移酶的底物且作为适合于唾液酸残基的转移的受体基团的位点。此类多于一个位点 原则上可以是锚定在糖蛋白的不同的糖基化位点的多个线性聚糖部分的末端。此外，支链 聚糖可以具有其中可以发生唾液酸化的多个位点。
[0007] 根据目前知识，可以发现末端唾液酸残基（i )α 2 -3( (12, 3)连接至半乳糖 基-R，（ii) α2 -6(α2,6)连接至半乳糖基_R，（iii) α2 -6(α2,6)连接至Ν-乙酰半 乳糖胺基_R，（ iv ) α 2 - 6 ( α 2, 6)连接至Ν-乙酰葡糖胺基-R，和（ν) α 2 - 8/9 ( α 2, 8/9) 连接至唾液酸基（sialidyl)-R，其中-R表示受体底物部分的其余部分。因此，唾液酸缀合 物的生物合成（="唾液酸化"）中有活性的唾液酸转移酶通常根据其各自的单糖受体底物 且根据其催化的糖苷键的3、6或8/9位置进行命名和分类。因此，在本领域已知的文献中， 例如在 Patel RY,等人，Glycobiology 16 (2006) 108-116 中，根据转移如115厶(：残基、 同时形成糖苷键的受体糖残基的羟基位置，参考真核生物唾液酸转移酶，诸如（i) ST3Gal、 (ii) ST6Gal、（iii) ST6GalNAc或（v) ST8Sia。也可以更通用的方式参考唾液酸转移酶， 例如，作为ST3、ST6、ST8 ;因此，"ST6"明确涵盖催化α 2, 6唾液酸化的唾液酸转移酶。
[0008] 二糖部分β -D-半乳糖基_1，4-Ν-乙醜基-β -D-匍糖胺（=Gal β 1，4GlcNAc)是 糖蛋白的N-连接的聚糖的触角（antennae)的常见末端残基，但也可以存在于0-连接的聚 糖和糖脂中。酶β-半乳糖苷-ct2,6-唾液酸转移酶（="ST6Gal"）能够催化聚糖的末端 Gal β 1，4GlcNAc或聚糖的支链（="触角（antennae) "）的α 2, 6-唾液酸化。对于其一般 方面，参考DallOlio F. Glycoconjugate Journal 17 (2000) 669-676 的文献。在人和其 他哺乳动物中，似乎存在几种ST6Gal。本公开特别涉及人β -半乳糖苷-α -2, 6-唾液酸转 移酶I (= hST6Gal-I ;根据IUBMB酶命名法，EC 2. 4. 99. 1)，但不限于此。
[0009] 唾液酸转移酶的ST6组包含2个亚组，ST6Gal和ST6GalNAc。ST6Gal酶的活性催 化Neu5Ac残基转移至作为聚糖的末端Gal β 1，4GlcNAc的部分或聚糖的触角的游离半乳糖 基残基的C6羟基，从而在聚糖中形成α 2 - 6连接至Gal β 1，4GlcNAc部分的半乳糖基残 基的末端唾液酸残基。聚糖中所得新形成的末端部分是Neu5Ac α 2, 6Gal β 1，4GlcNAc。
[0010] 人β -半乳糖苷-ct -2, 6-唾液酸转移酶I (hST6Gal-I)的野生型多肽在本文献 申请时在公开可得的 NCBI 数据库（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/115445)中被 公开为"UniPr〇tKB/SwiSS-Pr〇t:P15907. 1"。包括编码序列的进一步信息被提供为数据库 条目 "Gene ID:6480" 内编译的超链接（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gene/6480)。
[0011] 哺乳动物唾液酸转移酶与其他哺乳动物高尔基驻留的糖基转移酶共享所谓的" II 型结构"，其具有（i)短胞质N-末端尾部，（ii)跨膜片段，随后为（iii)可变长度的茎区 域和（iv)面向高尔基体的内腔的C-末端催化结构域（Donadio S.等人于Biochimie 85 (2003) 311-321)。哺乳动物唾液酸转移酶似乎在它们的催化结构域中表现出显著的序列 同源性。
[0012] Donadio S.等人在CH0细胞中表达hST6Gal_I的几种N-末端截短的变体，且发现 包含前35、48、60和89个氨基酸的N-末端缺失产生突变酶，然而其在将唾液酸转移至外源 受体中仍然具有活性。
[0013] 糖基化是影响蛋白折叠、稳定性和生物活性的调节的蛋白的重要的翻译后修饰。 唾液酸部分（=唾液酸，5-N-乙酰神经氨酸，Neu5Ac)通常暴露于N-糖基化的末端位置，因 此，对于生物识别和配体功能的重要贡献因素，例如，特征在于末端唾液酸的IgG被显示诱 导更少的炎症反应和增加的血清半衰期。
[0014] 使用糖基转移酶用于酶促合成定义的聚糖结构变为引导治疗性蛋白诸如抗体的 N-糖基化的工具。由于原核生物来源的糖基转移酶通常不对复杂糖蛋白结构起作用，所以 哺乳动物来源的唾液酸转移酶是优选的。例如，Barb等人（2009)使用分离的人ST6Gal-I 制备免疫球蛋白G的Fc片段的高度有效的唾液酸化的形式。然而，由于各种宿主（毕赤酵 母（Pichia pastoris)、草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)和大肠杆菌）中的低表达和 /或不良活性，重组ST6Gal-I用于治疗应用仍然受限。
[0015] 本领域已知的是，哺乳动物糖基转移酶可以有利地用于体外唾液酸化复杂的目标 分子诸如糖蛋白或糖脂。然而，相反的反应（唾液酸酶活性，从聚糖部分水解切割末端唾液 酸残基）通常由神经氨酸酶提供。然而，本发明人的初始发现是，哺乳动物来源的唾液酸转 移酶的变体表现出唾液酸酶活性。事实上，具有N-末端截短的人β -半乳糖苷-a -2, 6-唾 液酸转移酶I的特定变体可用于，（i)唾液酸化目标糖蛋白和（ii)从唾液酸化的目标糖蛋 白水解切割唾液酸残基两者。根据变体酶的动力学的控制，可以定量控制唾液酸化。也就 是说，本公开提供了与唾液酸化目标分子的两个或更多个或甚至所有受体位点相反，允许 唾液酸化几个受体位点中的仅一个的方式、方法和条件。
[0016] 这为许多不同的方法、特别是在体外糖工程改造免疫球蛋白和还有其他糖基化的 目标分子的领域中铺平了道路。此处，具体地和示例性地提供了导致产生主要单唾液酸化 或双唾液酸化的免疫球蛋白G分子的方法。然而，定量唾液酸化控制待唾液酸化的目标分 子的许多其他体外唾液酸化方法变得可行，且可以从本公开内容来推断。
[0017] 在一个具体实施方案中，本文献进一步公开了通过在HEK293细胞中瞬时基因 表达而高产量表达人β-半乳糖苷-ct _2, 6-唾液酸转移酶I的Λ89 N-末端截短变体 (hST6Gal-I，EC 2.4.99. 1;数据库条目P15907)，其中产率高达100 mg/L，特征在于令人惊 讶的不同的唾液酸化活性。
[0018] 概述 在一个方面，公开了具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列的N-末端截短的人β-半 乳糖苷-ct_2,6-唾液酸转移酶I用于水解Ν-乙酰神经氨酰基-(12,6-0-〇-半乳糖 基-1，4-N-乙酰基-β -D-葡糖胺部分中的a 2, 6糖苷键的用途，所述部分是唾液酸化的糖 蛋白或糖脂中的聚糖的末端结构。
[0019] 在一个进一步方面，公开了水解N-乙酰神经氨酰基-ct2,6-i3-D-半乳糖 基-1，4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分中的a2,6糖苷键的方法，所述部分是唾液 酸化的糖蛋白或糖脂中的聚糖的末端结构，所述方法包括以下步骤：(a)在水溶液中 提供在所述糖蛋白的聚糖部分中具有末端N-乙酰神经氨酰基-a 2, 6-β -D-半乳糖 基-1，4-Ν-乙酰基-β -D-葡糖胺部分的唾液酸化的糖蛋白或糖脂；(b)将Ν-乙酰神经氨 酰基-a 2, 6- β -D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-β -D-葡糖胺部分与具有SEQ ID N0:2的氨 基酸序列的N-末端截短的人β -半乳糖苷-ct-2, 6-唾液酸转移酶I孵育；从而水解N-乙 酰神经氨酰基-α 2, 6- β -D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-β -D-葡糖胺部分中的α 2, 6糖苷 键。
[0020] 在又一个进一步方面，公开了体外产生具有受控量的唾液酸残基的唾液酸化的 目标分子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在水溶液中和在允许糖基转移酶酶促活性 的条件下提供糖基化的目标分子，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多 个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基的C6位置具有 羟基的β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分；(b)通过在胞苷-5'-单磷 酸-N-乙酰神经氨酸或其功能等效物作为供体化合物存在的情况下将步骤（a)的目标分子 与具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列的N-末端截短的人β -半乳糖苷-α -2, 6-唾液酸转移 酶I孵育第一预定时间而形成一个或多个末端触角的Ν-乙酰神经氨酰基-a 2, 6- β -D-半 乳糖基_1，4-Ν-乙醜基-β -D-匍糖胺残基[=a 2, 6唾液酸化的末端触角残基]，从而提供 唾液酸化的目标分子；（c)通过将步骤（b)的唾液酸化的目标分子与具有SEQ ID N0:2的 氨基酸序列的N