同时鉴定果汁饮料中多种耐热菌的基因快速筛查方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于果汁饮料中耐热菌检测方法，特别是一种基于多重PCR技术以及毛细 管电泳分离技术，用于几种常见果汁饮料中耐热菌的基因快速筛选方法，涉及一种同时鉴 定果汁饮料中多种耐热菌的基因快速筛查方法。
【背景技术】
[0002] 果汁是人们生活中喜爱的液体饮料之一。果汁饮料，尤其是纯果汁里富含身体必 需的维生素和微量元素。随着消费者的健康意识增强，果汁饮料的消费量日益增加。果汁 是以水果为原料经过物理方法如压榨、离心、萃取等得到的汁液产品，汁按形态分为澄清果 汁和混浊果汁。澄清果汁澄清透明，如苹果汁，而混浊果汁均匀混浊，如橙汁。
[0003] 果汁饮料在生产过程中通常在生产厂房经过高温消毒处理，成批量包装，储存一 段时间后运往销售地；通常在运到销售地后，还要经过一段时间的储存，再到消费者手中。 在这个过程中往往是几个月，当这个批次的果汁中有极微量污染菌时，经过几个月时间微 量污染菌在运输和非冷藏环境中极有可能以果汁为丰富的培养基大量繁殖，从而造成异味 物质和引起果汁饮料浑浊，从而引起果汁饮料变质。
[0004] 果汁饮料中主要的耐热菌有球抱枝抱（Cladosporium sphaerospermum)，酸 土 环脂芽抱杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris)，丝衣霉花（Byssochlamys spectabilis)，腐败霉菌（Neosartoria fischeri)。这些菌具有耐热耐酸的特性，可经受果 汁巴氏杀菌过程而存活，从而对高温消毒处理后的果汁仍能造成危害。
[0005] 对于果汁饮料中微生物的检测方式主要分为两类，第一类是基于培养基的传统培 养法，国内外大多数果汁饮料厂采用此类方法，但检测时间长，且只能定量不能定性到种 属，因此无法及时指导生产技术人员对果汁饮料生产过程进行监控；第二类是基于PCR技 术的分子生物学检测方法，PCR技术从核酸、基因水平极大地提高了检测效率及灵敏度，能 够定性到种、属或一类目标菌，检测快速且定性能力强，因此无论对于成品果汁饮料质量的 监控，或者生产过程问题的溯源排查，PCR技术的应用都具有广阔的前景和深远的意义，但 一次反应只能检测一类微生物。
[0006] 大量实验已证实，上述几种果汁饮料主要耐热菌为厌氧菌，鉴别是一项较复杂的 工作，这些微生物需要严格的厌氧培养条件和冗长的孵育时间，检测过程复杂，因而有必要 进行更快速的检测方法。但目前检测方法多为培养基的传统培养法，或者使用单重PCR对 每个有害菌进行逐一检测，检测成本高、耗时费力，且不能一次反应得出检测结果，不利于 大量样品的快速检测。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术的缺陷，克服果汁饮料中主要耐热菌检测技术操作 繁琐，费时耗力等不足，提供一种同时鉴定果汁饮料中多种耐热菌的基因快速筛查方法，利 用由4对引物组成的引物体系，通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳 分离技术相结合的方式，从而实现对果汁饮料中是否存在耐热菌污染的检测。
[0008] 本发明的技术方案是：
[0009] 本发明针对4种耐热菌对样品进行分析，若能检测出其中任一种耐热菌，则说明 样品中含有具有果汁饮料污染能力的耐热菌。
[0010] -种果汁饮料耐热菌的快速筛查方法，采用4重PCR同时扩增4种耐热菌的基 因，再通过毛细管电泳分离所述4重PCR扩增产物，所述4重PCR反应中应用引物SEQ ID NO. 1 ~8〇
[0011] 本发明的果汁饮料耐热菌的快速筛查方法的方法，所述方法具体步骤如下：
[0012] 步骤（1)、果汁饮料耐热菌的培养及DNA模板提取：
[0013] 将检测样品在厌氧环境中26°C静置过夜富集培养，再通过真空栗过滤收集细胞 沉淀于滤膜上，将滤膜转移至反应试管，然后依次加入50mM EDTA 480ul、10mg/ml溶菌酶 120ul，37°C孵育60min，13, 000X g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取果汁饮料 耐热菌的DNA模板；
[0014] 步骤（2)、多重PCR扩增：
[0015] 将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
[0016] 所述的多重PCR扩增反应体系为20ul由ΙΟΟηΜ正向混合引物2ul，ΙΟΟηΜ反向混 合引物 2ul，25mM 的 MgCl24ul，5 X PCRBuffer4ul，5U/ul 的 Taq 聚合酶 0· 7ul，DNA 模板 lul 和余量双蒸水组成；正向混合引物中SEQ ID NO. 1引物、SEQ ID NO. 3引物、SEQ ID NO. 5、 SEQ ID NO. 7引物的浓度比为1:1:1:1，反向混合引物中SEQ ID NO. 2引物、SEQ ID NO. 4引 物、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8 引物的浓度比为 1:1:1:1。
[0017] 所述的多重PCR扩增反应的条件是95°C预变性lOmin ;以94°C 30s，58°C 30s， 70°C lmin为1个循环，共进行35个循环；4°C保温；
[0018] 表1本发明设计的用于耐热菌的基因检测的4重引物体系各引物序列
[0020] 步骤（3)、毛细管电泳分离条件：
[0021] 分离体系：lul所述步骤（2)中所得的扩增产物与体积含量为95%去离子甲酰胺 38. 5ul，400bpDNA MarkerO. 5ul 混合均匀；
[0022] 分尚条件：在50°C、6· 0KV电压下，分尚35min ;
[0023] 步骤（4)、检测鉴定：
[0024] 将步骤⑵中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分 析系统自动检索、收集样品中荧光信号判断是否在基因片段长度为171bp、256bp、265bp、 326bp相应位置处出现特征峰；若在171bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中 含有酸土环脂芽抱杆菌Alicyclobacillus acidoterrestris ;若在256bp相应位置处出现 特征峰，贝判断为该检测样品中含有球孢枝孢Cladosporium sphaerospermum ;若在265bp 相应位置处出现特征峰，贝判断为该检测样品中含有腐败霉菌Neosartoria fischeri ; 若在326bp相应位置处出现特征峰，贝lj判断为该检测样品中含有丝衣霉花Byssochlamys spectabilis。
[0025] 表2酸土环脂芽孢杆菌、球孢枝孢、腐败霉菌、丝衣霉花基因特征峰位置
[0028] 与现有技术相比本发明具有如下特点：
[0029] 其一，本发明可在同一 PCR管中进行，操作简单，能快速确定果汁饮料中是否存在 耐热菌，且检测结果准确；
[0030] 其二，通过分析基因确定酸土环脂芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris)，球抱枝抱（Cladosporium sphaerospermum),腐贝夂霉菌（Neosartoria fischeri),丝衣霉花（Byssochlamys spectabilis)在果汁饮料中的微量存在，及时发现 果汁饮料中有害菌，实现有效的监测及预防作用；
[0031] 其三，本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在 一次反应中集成检测4种果汁饮料耐热菌，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由 原7~14天缩短到8h。
【附图说明】
[0032] 图1为本发明具体实施例1的多重PCR-毛细管电泳谱图；
[0033] 图2为本发明具体实施例2的多重PCR-毛细管电泳谱图。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。
[0035] 实施例1 :
[0036] (1)果汁饮料耐热菌的培养及DNA模板提取：
[0037] 挑取平板培养基上长出的酸土环脂芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris)，球抱枝抱（Cladosporium sphaerospermum),腐贝夂霉菌（Neosartoria fischeri),丝衣霉花（Byssochlamys spectabilis)单菌落加入10mL成品苹果汁中，混 勾，制成菌悬液，取lmL该菌悬液加入1. 5ml离心管中，13, 000Xg离心2min，收集细胞沉 淀，移去上清液；加入480ul的50mMEDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌， 37°C孵育60min，13, 000Xg离心2min，移去上清液。之后按照Qiagen公司的Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取果汁饮料耐热菌的DNA模板，并使用紫外分光光 度计在260nm波长条件下测定提取的DNA质量，将DNA溶液稀释至250ng/ul，-20°C保存备 用。
[0038] (2)四重PCR扩增
[0039] 所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO. 1~8,20ulPCR反应体系：100nM正向混 合引物 2ul，ΙΟΟηΜ 反向混合引物 2ul，25mM 的 MgC124ul，5XPCRBuffer4ul，5U/ul 的 Taq 聚 合酶0. 7ul，DNA模板lul，补足双蒸水使总体积为20ul ;95°C预变性lOmin ;以94°C 30s ; 58°C 30s ;70°C lmin为1个循环，共进行35个循环；4°C保温；
[0040] (3)毛细管电泳分离条件
[0041] 分离体系：lul所述步骤（2)中所得的扩增产物与95%去离子甲酰胺38. 5ul， 400bpDNA MarkerO. 5ul混合均勾；分离条件：在50°C、6. 0KV电压下，分离35min ;
[0042] (4)数据分析
[0043] 使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System分析系统自动对 分离结果进行分析，结果图1所示，四种耐热菌