结核分枝杆菌RpsL突变基因及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种结核分枝杆菌RpsL突变基因及其用途，以及用于检测导致结核 分枝杆菌链霉素耐药基因 RpsL上游调控区突变-6C>T的试剂盒，属于结核病耐药基因突变 检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 结核病是由结核分枝杆菌引起的人畜共患病。对人类而言，结核分枝杆菌主要感 染青壮年人群，病程长，严重影响患者的正常生活和工作，对社会和家庭也带来极大危害。 近年，随着耐药结核杆菌株的出现，结核感染者数量呈增多趋势，结核病的发病率和死亡率 均有所上升，特别是多耐药、耐多药和广泛耐药结核患者的出现，更是给治疗带来极大困 难。超过半数的临床治疗结核花费用于5-20%的耐药结核患者，因此，对耐药结核分枝杆菌 耐药机制的研究亟待解决。目前临床抗结核一线用药主要为异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙 胺丁醇。此外，链霉素也作为抗结核联合用药常用在临床治疗中。
[0003] 链霉素是氨基糖苷类抗生素，是治疗结核病的常用临床药物。链霉素不可逆的结 合核糖体蛋白S12和16S rRNA，影响mRNA转录的起始，抑制蛋白质的合成。耐链霉素的主 要基因为rpsL基因。rpsL基因编码核糖体蛋白S12,易发生错义突变，常见的突变为43位 的赖氨酸突变为精氨酸和88位的赖氨酸突变为谷氨酸。Pelchovich等在结核菌耐链霉素 研究中，检测到rpsL基因的新突变91位的脯氨酸突变为组氨酸，该突变不仅导致链霉素耐 药的发生，还会使其它以核糖体为靶标的抗生素如庆大霉素耐药性增强。我们的研究中，发 现了一个新的突变位点，该突变位于rpsL基因上游6位碱基由C突变为T，该突变可能导致 rpsL基因的转录和翻译受到影响。
[0004] 由于各种耐药结核患者的出现及其数量的增多，对耐药结核分枝杆菌致病机制的 深入研究也越来越迫切。大量筛查耐药基因突变，丰富其突变谱，不仅为耐药结核菌试剂盒 的研发奠定基础，也为该类患者用药方针的调整提供依据。链霉素是临床常用抗结核药物 之一，也是常规联合用药之一，因此对结核杆菌耐链霉素 RpsL基因的突变热点区进行基因 检测，将有利于临床快速诊断和治疗。
[0005] 经文献检索，未见与本发明检测突变位点相同的公开报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌RpsL突变基因的方法，该结核分 枝杆菌RpsL突变基因具有-6C>T突变位点，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0007] 本发明另一目的是提供用于检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的试剂盒，该试剂 盒包括用于检测结核分枝杆菌RpsL基因-6C>T突变的试剂。
[0008] 本发明通过检测来自耐链霉素结核菌株的样本中是否存在RpsL基因的-6C>T突 变，从而判断该患者耐链霉素药物的耐药分子机制，其中-6C>T突变位点为RpsL基因的突 变，该突变导致RpsL基因编码区上游第六位碱基发生变化，这个突变影响了 RpsL基因基因 的表达，从而发挥其抗链霉素的作用，进而使该菌株产生耐药。
[0009] 发明人用候选基因筛查的方法，在中国23株耐链霉素结核菌株中进行检测，在一 株耐药结核菌种发现与耐链霉素相关的RpsL基因新突变-6C>T ;该突变的频率为4. 3%，这 说明在耐链霉素的结核菌株中，RpsL基因突变-6C>T具有一定的发生频率，因此RpsL基因 突变-6C>T可以作为临床链霉素耐药菌株耐药分子机制的诊断依据；并且目前，在国际和 国内均未见该突变的报道。
[0010] 本发明用于检测RpsL基因突变-6C>T的试剂盒，包括用于检测RpsL基因的突 变-6C>T所需的试剂和能选用的用于扩增RpsL基因的试剂和PCR引物。
[0011] 用于检测RpsL基因突变-6C>T的试剂盒，包括以下一种或几种试剂的组合： (1) 从待检样品中提取DNA的试剂； (2) 用于扩增结核菌样本DNA的RpsL基因 -6C>T突变的PCR引物和相关的PCR反应试 剂； (3) PCR产物纯化试剂； (4) 对PCR产物进行直接测序的试剂。
[0012] 用于检测RpsL基因突变-6C>T的试剂盒，所用的PCR引物为： RpsL-F :5' -ATGAGACGAATCGAGTTTGAGG-3， RpsL-R :5' -GATCGGTGCCGGTCTTGTCG-3' 用于检测RpsL基因突变-6C>T的试剂盒，所述检测PCR扩增产物的试剂选自测序检测 试剂、限制性内切酶长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂及 SNP分型检测试剂。
[0013] 采用PCR扩增-直接测序的方法来检测样本的突变情况，具体操作步骤如下： (1) 采集待测个体的样本，为培养的结核菌样本，提取全基因组DNA ; (2) 以提取的DNA为模板，以本发明设计的针对RpsL基因-6C>T突变的引物进行突变 区段DNA序列的扩增，得到相应的PCR扩增产物； (3) 将得到的PCR产物纯化后，进行直接测序分析，将所测得的序列与RpsL基因的正常 序列进行比对，确定-6C>T突变是否存在； (4) 根据以上实验结果分析患者是否为RpsL基因突变-6C>T导致的耐链霉素结核分枝 杆菌菌株。
[0014] 发明人在收集耐药结核分枝杆菌进行实验的过程中，收集到23株耐链霉素的结 核菌株，在取得患者同意的前提下，对患者感染的结核分枝杆菌进行基因检测。同时，我们 还收集了患者的基本信息和临床信息，详细询问了其感染和发病过程，建立了结核分枝杆 菌耐药株的样本库。将灭活的结核分枝杆菌冻存于-80°C冰箱。用柱吸附的方法提取结核 菌的基因组DNA，保存于-40°C冰箱，每份DNA样本具有对应的患者资料和耐药信息。用引 物设计软件Primer5和01ig〇6设计PCR扩增引物，包括了结核菌RpsL基因编码区上游113 位碱基到编码区下游171位碱基的DNA片段，用于PCR扩增。PCR扩增产物直接用PCR引物 进行正反向测序(测序所用仪器为ABI公司3730型DNA测序仪)。将得到的序列与GenBank 中的序列进行比对，确定RpsL基因突变-6C>T的存在。
[0015] RpsL基因 -6C>T突变的核苷酸和氨基酸序列如下： GCATGGCCGACAAACAGAAC GTGAAAGCGCCCAAGA.TAGA AAGC0GGTAGATGC CAACC A ; TCCAGCAGCTGGTCCGCAAG GGTCGT CGGGACAAGATCAG RpsL基因-6C>T突变的核苷酸和氨基酸序列中，用方框标出的是突变的碱基。该突变 位于RpsL基因编码序列前的第6位碱基，由野生型的胞嘧啶（C)变为胸腺嘧啶（T)，该突变 使RpsL蛋基因上游的调控序列发生变化，导致RpsL蛋白的转录和翻译发生改变，进而引起 链霉素的耐药。RpsL基因突变-6C>T的检测能够用遗传领域的任意一种点突变检测方法进 行，如PCR (聚合酶链反应）-RFLP法(限制性内切酶片段多态性)、PCR-测序法、DNA探针杂 交法、位点特异性PCR法、PCR-dHPLC (变性高效液相色谱)、及PCR-SSCP (单链构象多态性） 法。
[0016] 上述方法中得到的PCR产物还能用其他方法进行检测，如DNA杂交探针法。所用 探针能是与突变RpsL基因核苷酸序列杂交，也可以有两个探针分别与正常或突变的RpsL 基因核苷酸序列杂交。探针能够选择同位素标记、有色物质标记或荧光物质标记。此外，还 能够