骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种骨髓间充质干细胞的三维诱导培养 方法。
【背景技术】
[0002] 骨髓间充质干细胞（Mesenchymai stem cells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成 纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支 持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原 性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势， 因此，探讨MSCs体外诱导培养具有深远意义。
[0003]目前骨髓间充质干细胞的体外诱导多采用二维培养方式进行的，但二维培养无法 满足骨髓间充质干细胞在体内生长的三维环境，且由于骨髓间充质干细胞具有较强的贴壁 性，因此，在二维培养体系中，细胞易聚集成团，细胞与培养基及诱导液的接触面积较少，不 利于细胞的生长，从而造成细胞活性较差，诱导率低等缺陷。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中采用二维诱导培养体系诱导骨髓 间充质干细胞存在细胞活性差，诱导率低等缺陷，提供一种能够提高骨髓间充质干细胞诱 导率及细胞活性的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种骨髓间充质干细胞的三维 诱导培养方法，包括以下步骤：
[0006] 获取骨髓间充质干细胞，采用生物衍生骨进行体外培养；
[0007] 在体外培养过程中，用诱导液进行诱导反应。
[0008] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，获取骨髓间充质干细 胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，PBS缓冲 液离心洗涤，弃上清液。
[0009] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，所述生物衍生骨的制 备过程包括以下步骤：取骨块于H202中浸泡36~80小时，每24小时换液一次；再浸泡于 双蒸水中20~60分钟后，依次于乙醇和丙酮中分别浸泡12~36小时后，再于双蒸水中浸 泡20~60分钟后，干燥冷冻，并灭菌。
[0010] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，进行体外培养之前， 还包括对所述生物衍生骨预处理的过程，包括以下步骤：将所述生物衍生骨浸泡于PBS溶 液中1-3天，去除骨渣，然后浸泡于无血清培养基中2-4天，再加入FBS浸润1-5小时，获得 浸润后的生物衍生骨。
[0011] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，所述体外培养过程包 括以下步骤：
[0012] 将骨髓间充质干细胞接种于浸润后的生物衍生骨，静置4-6小时后，加入完全培 养基进行扩增培养，获得扩增后的骨髓间充质干细胞。
[0013] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，所述完全培养基中 添加有80-120U/ml的青霉素、80-120mg/ml的链霉素、0. 15-0. 50mg/ml的谷氨酞胺以及 l-5mg/ml 的 HEPES 缓冲液。
[0014] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，用所述诱导液进行诱 导反应的过程步骤为：
[0015] 用所述诱导液对扩增后的骨髓间充质干细胞进行诱导培养7-10天，每2-4天换液 一次。
[0016] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，所述诱导液包括 10 7-10 9mol/L的地塞米松、25-75 μ g/ml的维生素 C和5-15mmol/L的β -甘油磷酸钠。
[0017] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，所述体外培养过程是 在氧气体积百分比为〇. 5%~6%的环境中进行的。
[0018] 实施本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，可以达到以下有益效 果：通过采用经处理后的生物衍生骨作为三维培养支架，不仅能够维持模拟骨髓微环境的 三维多孔结构，提高骨髓间充质干细胞的吸附能力及生长增殖能力等，而且利用生物衍生 骨良好的骨传导性和骨诱导性，从而提高了骨髓间充质干细胞的诱导转化率及细胞活性， 解决了现有技术中，采用二维培养体系诱导培养骨髓间充质干细胞存在的细胞活性差，骨 髓间充质干细胞的诱导转化率低等问题。
【具体实施方式】
[0019] 为解决现有技术中采用二维体系诱导培养骨髓间充质干细胞存在细胞活性差，诱 导率低等缺陷，本发明的创新点在于提供一种三维培养体系以模拟骨髓微环境进行诱导培 养骨髓间充质干细胞的方法，避免了骨髓间充质干细胞在二维培养体系中易聚集成团，与 培养基及诱导液接触面积较少，不利于诱导培养的问题，从而可提高骨髓间充质干细胞的 细胞活性，并提高骨髓间充质干细胞的诱导转化率。
[0020] 具体地，本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，包括以下步骤：
[0021] S1、获取骨髓间充质干细胞；
[0022] S2、制备生物衍生骨；
[0023] S3、预处理生物衍生骨，获得浸润后的生物衍生骨；
[0024] S4、将骨髓间充质干细胞接种于浸润后的生物衍生骨内进行扩增培养后，再用诱 导液进行诱导反应。
[0025] 进一步地，步骤S1 :获取骨髓间充质干细胞的具体过程为：
[0026] 采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，加入PBS缓冲 液，离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。
[0027] 可以理解的是，上述骨髓间充质干细胞的获取方式仅为本发明提供的其中一种， 本领域技术人员采用其他方式获取的骨髓间充质干细胞同样适用于本发明；另外，也可利 用现有技术中骨髓间充质干细胞的分离纯化方法对步骤S1获取的骨髓间充质干细胞作进 一步纯化。
[0028] 步骤S2 :生物衍生骨的制备具体包括以下步骤：
[0029] 取lcmXO. 5cmX0. 5cm骨块于H202溶液中浸泡36~80小时，每隔一段时间换液 一次，对骨块进行杀菌脱蛋白；再浸泡于双蒸水中20~60分钟后，依次于乙醇和丙酮中分 别浸泡12~36小时，去除骨组织中残留的蛋白，再于双蒸水中浸泡20~60分钟后，干燥 冷冻，并灭菌，即获得生物衍生骨，密封保存。
[0030] 经过上述物理、化学处理后获得的生物衍生骨，去掉了骨块中的细胞成分及抗原 性，基本保持了原来生物体内的孔隙网架结构，有利于细胞粘附、生长并为细胞外基质分泌 提供充分的空间及表面积，同时还具有良好的骨传导性和骨诱导性，有利于促进骨髓间充 质干细胞转化成成骨细胞。
[0031] 步骤S3 :预处理生物衍生骨，以增强生物衍生骨表面的细胞亲和性，有利于细胞 贴附，并使培养基中的细胞因子和营养因子部分融入到生物衍生骨内，有利于骨髓间充质 干细胞的生长，具体过程为：
[0032] 将S2中获得的生物衍生骨浸泡于PBS溶液中1-3天，去除骨渣，然后浸泡于无血 清培养基2-4天，再加入FBS (胎牛血清）浸润1-5小时，获得浸润后的生物衍生骨，以使生 物衍生骨中融有无血清培养基及FBS，更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁生长。
[0033] 步骤S4 :将步骤S1获取的骨髓间充质干细胞接种于步骤S3中预处理的生物衍生 骨上并进行多次扩增培养后，加入诱导液进行诱导培养；
[0034] 需要说明的是由于骨髓间充质干细胞主要定居于骨髓的干细胞龛内，而氧气体积 百分比在干细胞龛内血供较差的部位仅为1 %，而在血窦附近的则有6 %，因此，本发明步 骤S4全程是在氧气体积百分比为0. 5%~6%的环境中进行的，以模拟骨髓微环境，从而更 有利于骨髓间充质干细胞的生长和增殖，该步骤具体过程为：
[0035] S41、将骨髓间充质干细胞与步骤S3中获得的浸润后的生物衍生骨混合，静置4-6 小时后，待骨髓间充质干细胞与生物衍生骨充分贴附后加入完全培养基于体积百分比为 0. 5%~6% 02条件下进行第一次扩增培养，2-4天后，将生物衍生骨转移至新的孔板中，以 剔除死细胞，添加完全培养基继续进行第二次扩增培养；当然也可根据实际情况进行三次 以上扩增培养，以获取足够量的骨髓间充质干细胞。
[0036] 其中，完全培养基为含有10% FBS、0. 15-0. 50mg/ml谷氨酞胺、80-120U/ml青霉 素、80-120mg/ml 链霉素和 l-5mg/ml 的 HEPES 的 L-DMEM 培养基。
[0037] 其中，胎牛血清中含有丰富的细胞生长所必须的营养成份，能够提供对维持细胞 指数生长的激素、基础培养基中没有或量很少的营养物、以及主要的低分子营养物，是细胞 贴壁、铺展在培养基质上所需因子来源；并且能够提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩 余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。
[0038] 谷氨酞胺是细胞生长的必须氨基酸，为骨髓间充质干细胞提供重要的能量来源； 脱掉氨基后，谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢，促进细 胞分裂，因此能够促进骨髓间充质干细胞的生长和增殖。
[0039] HEPES能够防止培养基pH迅速变动，并维持培养基的pH值在7. 0左右。
[0040] 青霉素能够阻碍细菌的细胞壁合成，导致细胞泄漏死亡，从而抑制细菌的生长；链 霉素能够作用于细菌的核糖体，阻碍蛋白翻译，从而抑制细菌生长；自然环境下，不考虑人 为产生的抗药性，对青霉素不敏感的绝大多数微生物对链霉素敏感，反之亦然；因此，最为 优选地是将青霉素和链霉素搭配使用能够控制几乎全部常见的细菌，从而能够尽量避免细 菌对骨髓间充质干细胞的生长及活性造成的不良影响。因此，采用该血清培养基培养间充 质干细胞不仅可以促进骨髓间充质干细胞生长和增殖，而且可避免培养过程中产生的细菌 对细胞活性造成的影响。
[0041] 因此，本发明中采用该完全培养基结合生物衍生骨三维孔隙结构，不仅能够保证 骨髓间充质干细胞在扩增阶段能够保持细胞活性，而且能够促进骨髓间充质干细胞的分 裂，促进细胞生长增殖，以获取更多的骨髓间充质干细胞。
[0042] S42、待骨髓间充质干细胞第二次扩增培养2-4天后，再加入成骨诱导培养基于氧 气体积百分比为〇. 5%~6%的环境中进行诱导培养7-10天，每2-4天半量换液一次；
[0043] 其中，成骨诱导培养基为包含有10% FBS和诱导液的L-DMEM培养基，诱导液包括 10