一种达氏鲟精原细胞培养液及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种达氏舞精原细胞培养液及应用。
【背景技术】
[0002] 达氏舞（Acipenserdabryanus)属舞形目，舞科，舞属，又名沙腊子、长江舞，是我 国特有物种，为淡水定居性舞鱼类（丁瑞华1994)。主要分布于金沙江下游及长江上游，具 有较高的经济价值和科研价值。近年来，由于环境污染、生境破坏、航运和过度捕捞等因素， 野生达氏舞种群数量急剧下降。近20年来，由于葛洲坝工程的兴建以及长江上游的环境 污染、过度捕捞等原因，达氏舞的资源已极为稀少（ZhuangPing et al 1996，Zhanghui et al 2011)。1988年，达氏舞被世界自然与资源保护联盟（International Union for the Conservation of Nature and Natural Resources)红色名录列为极度颜危（Critical endangered，CR)物种。因此，开展达氏舞种质资源保护技术的研究，对于保护达氏舞物种资 源，对于品种的开发利用等都有重要的意义。
[0003] 2006年，日本学者Okutsu等建立了虹鳟的精原细胞移植技术。将A型精原细胞的 一部分移植到腹膜受体虹鳟胚胎，向受体胚胎生殖腺移动，并在其内增殖，然后产生了大量 功能性的精子。这些结果在功能上证实鱼精巢中存在精原细胞。此外，Okutsu还发现精原 细胞合并到雌鱼卵巢中，分化为功能齐全的卵，表明整合的精原细胞具有双性潜能。最后， 正常生物个体可以通过来自供体精原细胞形成的配子受精产生。2007年，代理亲鱼技术建 立，可将精原细胞异种移植入近缘种。通过这种技术，可将苗种生产昂贵、世代时间长的大 型鱼类的精原细胞移植到亲缘关系相近但体型较小，世代时间较短的鱼种中，缩短世代时 间。因此达氏舞精原细胞移植可作为达氏舞物种保护的对策之一。通过建立一种达氏舞精 原细胞体外培养方法，可使精原细胞长时间在体外扩增和维持，并同时保持其原有的特性， 可以保证用于移植的精原细胞长期大量稳定的供应。
[0004] 目前鱼类精原细胞体外培养研究大多集中在斑马鱼（Danio rerio) (Sakai 2002， Kurita2004)青鎌（Oryziaslatipes) (Hong 2004)、日本暢麵（Anguilla japonica) (Miura et al.2006,0zaki et al.2006,0hta et al· (2007))、红罗非鱼（Oreochromisniloticus) (Lacerda 2〇10)、南亚野鏡（Labeorohita)(Panda 2〇11)、虹蹲（Oncorhynchus mykiss) (Okutsu 2007, Shikina 2008,2010)等物种上。但目前未发现达氏舞精原细胞分离培养方 法的相关报道。
[0005] 达氏舞精原细胞培养液是进行精原细胞长期培养的关键因素之一。本发明提供一 种多种成分所组成的适用于达氏舞精原细胞培养的培养液。这种培养液不含胎牛血清，能 够实现达氏舞精原细胞的长期培养。本发明的培养液可用来建立达氏舞精原细胞系，用于 长期培养达氏舞精原细胞。本发明还涉及所述的精原细胞培养液在长期保存达氏舞精原细 胞中的用途。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种达氏舞精原细胞培 养液。该培养液特异性的针对精原细胞的培养，使得达氏舞原代精原细胞在体外生长更容 易增殖，为达氏舞生殖发育研究提供有效的细胞平台。
[0007] 本发明还有一个目的是提供了一种达氏舞精原细胞培养液在培养精原细胞中的 应用。
[0008] 本发明解决所述技术问题的方案，包括以下步骤：
[0009] 一种达氏舞精原细胞培养液，包括：
[0010] 牛血清白蛋白(BSA> 4-6g/L L-GluiMTiine 0-40mrn〇i/L B27 Supplement l-9ml/L L-Lys ?-40mg/L L-Pro 3-40mg/L L^-Asp 3-'40!ng/L 丙酮酸钠 20-190mmol/L 达氏鲟血清 10-200mi/L 青霉素 2ΟΟΟ〇ΜΗ5/1_·-45,0ΟΟΟιιη?域 链霉素 l-45mg/L 两性霉素 B 15-I00mg/L LIF生长因子 3-47mg/L GDNF生长因子 3-47mg/L bFGF生长因子 3 -47mg/L
[0011] 其余为 StemPre?-34 SFM 培养液；
[0012] 所述的达氏舞精原细胞培养液pH为7. 7-8. 3。
[0013] 优选的，所述的达氏舞血清为2龄雄性达氏舞血清。
[0014] 一种达氏舞精原细胞培养液，包括：
[0015] 牛血清白蛋白(BSA> 4.2-5.8g/I. L-Glutiirnine 0.5-2〇!rimol/L
[0016] B27 Suppleinexit： 2-8ml/L L-Lys 5-35mg/L L-Pro 5-35mg/L L^Asp 5-35iBg/L 丙酮酸钠 30-170mmol/L 达氏鳄血清 20-170ml/L 青霉素 链霉素 3-40mg/L 两性霉素 B 2：D-80mg^L LIF生长因子 5-45mg/L GDNF生长因子 5-45mg/L bFGF 生长因子 5-45:.mg/L
[0017] 其余为 Stetofto?-M SFM 培养液；
[0018] 所述的达氏舞精原细胞培养液pH为7. 8-8. 2。
[0019] 一种达氏舞精原细胞培养液，包括：
[0020] 牛血清白蛋白(BSA) 4,5-5.5g/L L-Gh.3tamine i-lOnunoi/L B27 Supplement 3-7ml/L bLys IGoOing/L L-F5ro i0-30mg/L L-Asp i 0-30mg/L 丙酮酸钠 60-13 Ommol/L 达氏鲟血清 30-120ml/L 青霉素 5OOOOimits/I^35、00〇_iils/L 链霉素 5-35mg/L 两性霉素 B. 25-75mg/L Lirl-.ulAl f 10-40mg/L GDNF 生长因子 10-40mg/L bFGF，l·. KN 丫 10-40mg/L
[0021]其余为 StemPm?·34 SFM 培养液；
[0022] 所述的达氏舞精原细胞培养液pH为7. 8-8. 2。
[0023] -种达氏舞精原细胞培养液，包括：
[0024] 牛血清白蛋白(BSA) 4.9-5. Ig/L L-Glu ta mine I -5mm()l/L B27 Suppieirient: 4-6inI/L L-Lys 丨 5-25mg/L L-Pro 15-2 5 mu; L L-Asp 15-2 5 mg/ L 丙酮酸钠 7042CtomoVL 达氏鲟血清 50-90ml/L 青_素 ?Ο,ΟΟΟΟ 皿 fts/L-3:O,〇i]〇0uniis/L 链霉素 10-30mg/L 两性霉素 B 30-70mg/L L1F 生长因子 __20-30fxlg/_L GDNF 生长因子 20-30mg/L bFGF 生长因子 20-3〇mg/L
[0025] 其余为.SteniPri)$^3:4 SFM 培养液；
[0026] 所述的达氏舞精原细胞培养液pH为7. 9-8. 1。
[0027] -种达氏舞精原细胞培养液，包括：
[0028] 牛血清白蛋白(BS在）ig/L L-G!i!tamine 2mmoi/L B27 Supplement 5mi/L L-Lys 2〇mg/L L-Pro 20mg/L L-^sp 20mg/L .丙丽酸偷： lOQmwl/L 达氏鲟血清 70mi/L 青霉素 200000imus/L 链霉素 ^Qmg/L
[0029] 两性霉素 B SOmg/L LIF生长因子 25mg/L GDNF生长因子 25mg/'L bFGF生长因子 25mg/L
[0030] 其余为StemPn)彳-34 SFM培养液；
[0031] 所述的达氏舞精原细胞培养液pH为8. 0。
[0032] 以上保存液的pH通过1M NaHC03或25mM HEPES调节。
[0033] -种达氏舞精原细胞培养液在培养精原细胞中的应用，包括利用所述的培养液为 有效成分制备成达氏舞精原细胞培养液，或直接将该培养液用于达氏舞精原细胞的培养。 [0034] 具体的，将该培养液用于达氏舞精原细胞的培养步骤包括：
[0035] (1)达氏舞精巢细胞悬液制备：
[0036] 以下操作均在无菌生物安全柜中进行。
[0037] 1)清洗干净的达氏舞精巢组织移到培养皿中，将精巢组织剪碎，以消化液：组织 块=4:1 (v/w)的比例添加0. 25 %胰蛋白酶消化液，20°C培养箱中消化，每30min吹打一次。
[0038] 2)将步骤1)中的精巢组织消化3h后，加 L-15培养基+20%胎牛血清终止消化， 40 4111滤网过滤。4°C，200g离心5min，L-15培养基+20%胎牛血清重悬。
[0039] 3)细胞计数，并用台盼蓝：细胞悬液=1:1 (v/v)染色，在显微镜下计算活细胞率 后，用L-15+20%胎牛血清以IX 105个/ml稀释细胞。
[0040] 4)将稀释后的细胞悬液接种至细胞培养瓶中，21°C培养箱中培养36h后，用移液 管轻轻吹打培养瓶瓶壁，使未贴壁的细胞落下，收集培养液，l〇〇〇r，室温离心5min。
[0041] 5)离心后弃上清，用达氏舞精原细胞培养液重悬细胞，，21°C培养箱中培养。
[0042] 6)每 3d_4d 换液一次。
[0043] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0044] 本发明首次提供了一种专用于达氏舞精原细胞的培养液，解决了目前达氏舞精原 细胞原代无法大量培养的问题，为达氏舞生殖发育研究提供有效的细胞平台。
[0045] 常用的细胞培养基中含有胎牛血清成分，它对维持细胞生长、贴壁、解毒、抑制蛋 白酶的活性及维持培养液的酸碱度等都具有重要作用。但是胎牛血清成分复杂、品质不稳 定，常影响实验结果的准确性。目前有关精原细胞培养的报道表明，培养基内胎牛血清浓度 过高，能显著地促进精巢体细胞的增殖，形成生长优势，从而抑制精原细胞的增殖。本发明 提供了一种无胎牛血清、以各种生长因子、非必须氨基酸、丙酮酸钠等添加剂作为替代物， 同时辅以少量雄性达氏舞血清的低血清培养基，可保证精原细胞的大量增殖且精巢细胞增 殖率较低。
【附图说明】
[0046] 图1为实施例7中原代培养12d的精原细胞。
【具体实施方式】
[0047] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料， 如未特备说明，均来自于商业渠道。
[0048] 实施例1 :
[0049] 一种达氏舞精原细胞培养液，包括：
[0050] 牛血清白蛋白(BSA> 5g/L L-Glutamine 2mmol/L B27 Supplement 5ml/L L-l；ys JOrng/L L-Pro 20mg/*L· L-Asp 20mg/L '詩酮酸钠 lOOinmol/L 达氏鲟血清_ 70mUL 青霍素：纖〇〇0珊眺. 链霉素 Mrag/L 两性霉素 B 50mg/L UF生长因子 ：23.nig/L GDNF生长因子 25mg/L bFGF生长因子 25mg/L
[0051] 其余为 StemPmci-M SFM，培养液 pH 为 8. 0。
[0052] 所述的达氏舞精原细胞培养液的制备方法，包括以下步骤：
[0053] 1.各成分母液的配置：
[0054] (l)10ml 500