一株无苹果酸副产的l-天冬氨酸酶重组大肠杆菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶 重组大肠杆菌及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] L-天冬氨酸在医药、食品和化工等方面有着广泛的用途。在医药方面，是氨基酸制 剂的主要成分；在化工方面，可以作为制造合成树脂的原料，大量用于合成环保材料聚天门 冬氨酸；尤其在食品工业方面，L-天门冬氨酸是一种良好的营养增补剂，也是糖代用品阿 斯巴甜的主要生产原料。具有良好的市场前景。
[0003] 目前L-天冬氨酸主要以富马酸为原料，采用生物酶法合成。由于采用全细胞或是 细胞破碎后的粗酶液进行转化，因此转化体系中含有两种可以催化富马酸的酶，即富马酸 酶和L-天冬氨酸酶，前者催化富马酸合成苹果酸，后者催化富马酸合成L-天冬氨酸。副产 物苹果酸的合成不仅降低了目标产物的转化率，同时也增加了下游产物分离纯化的难度。 因此构建一株具有高活性的L-天冬氨酸酶活性且无富马酸酶活性或低富马酸没活性的重 组菌可有效降低L-天冬氨酸生产过程成本。
【发明内容】
[0004] 本发明要求解决的技术问题是，提供一株无苹果酸副产的L-天冬氨酸酶重组大 肠杆菌。
[0005] 本发明还要解决的技术问题是，提供上述无苹果酸副产的L-天冬氨酸酶重组大 肠杆菌的制备方法。
[0006] 本发明最后要解决的技术问题是，提供上述无苹果酸副产的L-天冬氨酸酶重组 大肠杆菌在制备L-天冬氨酸中的应用。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0008] -株无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌，将耐铵型大肠杆菌BEW308 中编码富马酸酶的基因 fumA、fumB、fumC中的一个或几个基因失活，再将编码L-天冬氨 酸酶基因插入到编码富马酸酶fumAC基因的位置，即得到无苹果酸副产的产L-天冬氨酸 酶重组大肠杆菌，所述的大肠杆菌耐铵型大肠杆菌BEW308,该菌株的保藏号为CCTCC N0 : M2013157。所述的CCTCC N0:M2013157菌株为一株铵根离子耐受型大肠杆菌，该菌株的具 体信息在申请号为201310279778. 6专利中已经公开。fumA和fumC这两个基因在基因组上 是相连的。fumA、fumB、fumC 的基因的 EcoGene 登记号分别为 EG10356，EG10357，EG10358。
[0009] 其中，所述的编码L-天冬氨酸酶基因其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0010] 其中，所述编码L-天冬氨酸酶基因，其起始密码子的上游有一段信号肽，该信号 肽的核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0011] 上述的无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌的制备方法，包括如下步 骤：
[0012] (1)将pKD46质粒转入耐铵型大肠杆菌BEW308中，筛选出阳性转化子大肠杆菌 BEW308-pKD46,利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将大肠杆菌BEW308-pKD46制备 成感受态细胞；
[0013] (2)以PIJ773质粒为模板，SEQ ID Ν0 :3和SEQ ID Ν0 :4所示的序列为引物，PCR 扩增得到fumB基因敲除片段；
[0014] (3)将步骤（2)得到的fumB基因敲除片段电转化至大肠杆菌BEW308-pKD46制备 成感受态细胞中，在安普抗性平板上筛选阳性重组子；
[0015] (4)将步骤（3)得到的阳性重组子制备成感受态细胞，将pCP20质粒转化其中， 42°C诱导FLP重组酶表达，在安普霉素抗性平板和无抗性的平板上进行双挑实验，在物抗 性的平板上生长，但不能在有安普霉素抗性的平板上生长的菌株为fumB基因失活的菌株 BEW308- Δ fumB ；
[0016] (5)人工合成在SEQ ID NO :1起始密码子ATG前添加了 SEQ ID NO : 2所示核苷酸 序列的基因敲除片段；（6)将步骤（4)得到的fumB基因失活的菌株BEW308- Λ fumB制备 成感受态细胞，将PKD46质粒转化其中，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将其制 备成感受态细胞；
[0017] (7)将步骤（5)中的核苷酸序列转化至步骤(6)的含有λ重组酶的感受态细胞 中，在安普抗性平板上筛选阳性重组子；
[0018] (8)将步骤（8)中的阳性重组子制备成感受态细胞，将pCP20质粒转化将pCP20质 粒转化其中，42°C诱导FLP重组酶表达，在安普霉素抗性平板和无抗性的平板上进行双挑 实验，在物抗性的平板上生长，但不能在有安普霉素抗性的平板上生长的菌株即为无苹果 酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌BEW308- Λ fumB- Λ fumAC-aspC。
[0019] 上述无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌在生产L-天冬氨酸中的应用 在本发明的保护范围之内。
[0020] 其中，利用无苹果酸副产的产L-天冬氨酸酶重组大肠杆菌发酵产L-天冬氨酸酶， 再利用L-天冬氨酸酶发酵液催化富马酸氨转化为L-天冬氨酸。
[0021] 其中，所述的发酵产L-天冬氨酸酶，其发酵培养基配方为：酵母粉24g/L，蛋白胨 10g/L，K2HP0436mmol/L，MgS0410mmol/L，微量元素[CaCl 2. 6H20 0· 74g/L，ZnS04. 7H20 0· 18g/ L，MnS04. H20 20g/L，Na2. EDTA20. lg/L，CuS040. lg/L，C0C120. 104g/L, FeS04. 7H20 2g/L]2mL/ L，溶剂为水，pH用NaOH调到7. 2~7. 5。
[0022] 其中，所述的发酵产L-天冬氨酸酶，其发酵过程中，温度为28~30°C，pH为7. 2~ 7. 8,溶氧为5~40%。
[0023] 其中，利用L-天冬氨酸酶发酵液催化富马酸氨转化为L-天冬氨酸的条件为：温度 30~37°C，转速为100~200r/min，反应时间为12~24小时。
[0024] 其中，利用发酵液催化富马酸氨转化为L-天冬氨酸，催化体系中富马酸的浓度为 150 ~200g/L。
[0025] 有益效果：
[0026] (1)本发明可实现L-天冬氨酸酶的组成型高活性表达，且发酵培养后获得的细胞 或是粗酶液具有低富马酸酶活性。
[0027] (2)微有氧培养该重组菌，将其游离细胞或是简单冻溶后的粗酶液与富马酸铵混 合后，其转化产物中主要是L-天冬氨酸（底物的摩尔转化率超过99. 5% )，无苹果酸积累。 该方法可有效提高底物富马酸的转化收率，降低副产物的生产，有效降低生产成本。
【附图说明】
[0028] 图1敲除fumB基因的线性片段PCR图，泳道Μ为marker，泳道1为线性片段
[0029] 图2菌落PCR鉴定图，其中BEW308泳道为出发菌株，Μ为Marker，1~8为鉴定的 单菌落。
【具体实施方式】
[0030] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0031] 实施例1 :
[0032] 本实施例说明利用同源重组技术敲除亲本耐铵型大肠杆菌BEW308中富马酸酶 fumB基因，得到消除安普霉素抗性菌株的过程。
[0033] (1)利用LB培养基，于37°C、有氧条件下培养大肠杆菌BEW308至0D6QQ= 0· 4~ 0.6,制备成电转感受态；
[0034] (2)将重组质粒电转入感受态的大肠杆菌BEW308。电击条件为：200 Ω，25 μ F，电 击电压2. 3kv，电击时间4~5ms。电击后迅速将菌体加入预冷lmL的S0C培养基，150r/ min、30°C培养lh之后涂布于带氨节青霉素（amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子 BEW308 (pKD46)；
[0035] (3)在LB培养基中加入10mM的L-阿拉伯糖，于30°C下诱导质粒pKD46表达出λ 重组酶，制成电转感受态；
[0036] (4)以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统， 以质粒PIJ773为模板，并设计两端带有fumB同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片 段，引物序列如下：
[0037] 上游带同源臂引物H1-P1(SEQ ID N0:3):
[0038] 5 ' -CGGCACGCCATTTTCGAATAACAAATACAGAGTTACAGGCTGGAAGCTATTCCGGGGATCCGTCGA CC-3'
[0039] 下游带同源臂引物H2-P2(SEQ ID N0:4):
[0040] 5 ' -TTACTTAGTGCAGTTCGCGCACTGTTTGTTGACGATTTGCTGGAAGAATGTAGGCTGGAGCTGCT TC-3'
[0041] 反应体系：带同源臂的上下游引物（lOOpmol/ μ 1)各0· 5 μ 1 ;模板DNA(100ng/ μ 1)0. 5 μ 1 ； 10 Xbuffer 5 μ 1 ；dNTPs(10mM) 1 μ 1 ；DMS0(100% ) 2. 5 μ 1 ；Pyrobest DNA 聚合酶（2· 5U/ μ 1) 1 μ 1 ;ddH20 36/35. 5 μ 1 ;总体积 50 μ 1。
[0042] 反应条件：94 °C，2min ;(94 °C，45sec ;50 °C，45sec ;72 °C，90sec ;10 个循环）； (94°C，45sec ;55°C，45sec ;72°C，90sec ;15 个循环）；72°C，5min〇
[0043] 线性DNA片段的鉴定如图1。
[0044] (5)电转线