一种全食副球菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物及用途，具体地说是一种全食副球菌菌株及其在含吡啶废水治 理中的应用。
【背景技术】
[0002] 啦啶（/yrii/ifle)是含有一个氮原子的六元杂环化合物，属难降解有机污染物；其 分子式为C5H5N，易燃，有害。吡啶存在于煤焦油中，在化工行业常用作原料和溶剂。吡啶毒 性大，吸入就能够对人体产生危害，还会对眼及上呼吸道产生刺激作用，严重时会麻醉中枢 神经系统。
[0003] 吡啶在医药和农药领域使用较为广泛，多用于制造维生素、抗组胺类药、除草剂及 塑料等。吡啶是酰化反应的优良溶剂，还能够以络合物的形式催化一些氧化反应、聚合反应 和羰基化的反应。随着吡啶需求量的增加，吡啶的排放量势必增长，含吡啶的废水如不经过 任何处理而随意排放，不但会对环境造成严重污染，更会影响人类健康。目前，现有技术中 对含吡啶的废水的处理主要采用物理化学法。如CN 105000616 A公开了一种废水中残余 吡啶的去除方法，是采用气体吹脱方法将空气通入含吡啶废水中，使废水中的残余吡啶由 液相转为气相，然后收集含吡啶气体用RT0焚烧炉焚烧。该方法利用吹脱法将空气通入废 水中，改变有机物吡啶溶解于水中所建立的平衡关系，将水相中的吡啶转移到气相中，使吡 啶盐转化为吡啶，收集吹脱出的含吡啶空气采用RT0焚烧炉焚烧处理，气相中的吡啶经焚 烧后氧化成水、二氧化碳和二氧化氮排放于大气中。该方法去除效率较高，从根本上去除了 废水中的吡啶，消除了环境污染；但是存在需要专门的焚烧设备、碳排量较高、处理过程能 耗大、成本高、焚烧过程具有较大的安全隐患等弊端。可见，我们非常有必要探究更为安全、 环保、实用的降解处理方法。与物理化学方法相比，生物降解法可实现无害化治理，具有处 理量大，成本低，条件温和，不产生二次污染等特点，是目前应用最广、最有效的降解有害物 质的处理方法，但是生物降解法的有效性往往取决于高效降解菌株，因此，从自然环境中筛 选得到能够去除吡啶的有效菌种并将其应用于工业废水的处理中将具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一是提供一种全食副球菌菌株，以期高效降解废水中含有的吡啶 有害物质，为采用生物降解法治理含吡啶废水提供基础；本发明的目的之二是提供一种降 解废水中吡啶的方法，以解决现有方法处理废水中的吡啶存在成本高、处理过程复杂以及 存在安全隐患的问题。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种全食副球菌菌株，所述菌株保藏 名称是全食副球菌/Λ3Λ ?ο B21 -3，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年10月9日，保藏编号为CGMCC Ν0. 11474 ; 保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0006] 本发明所述的全食副球菌B21-3的细胞形态为球形，菌落呈淡粉色，表面粘质，边 缘整齐，易挑起；为革兰氏阴性细菌，其氧化酶和接触酶为阳性；甲基红和VP试验结果呈阴 性。
[0007] 本发明所述全食副球菌jOawioiTOjOAiAs·) B21-3 米用细菌 16S rRNA 基 因通用引物27f和1492r对16S rRNA基因进行PCR扩增，扩增结果经北京宝锐通生物技术 有限公司进行序列测定，其16S rRNA基因序列如SEQ ID N0:1所示；测定结果提交GenBank 数据库经Blast同源性比对，结果表明全食副球菌（/kracocciA? 的 16S rRNA基因序列与全食副球菌ATCC355121")的同源性为 99. 49%〇
[0008] 本发明提供的全食副球菌（/kracocciA? /Λ3/7 ?ο B21 -3将实验证明其能 以吡啶为唯一碳源、氮源进行生长，并将其氧化为氨氮，由此完成了全食副球全食副球菌 (/Λ3/7 ?ο B21-3 在降解吡啶中的应用。
[0009] 本发明提供的全食副球菌（/^aracocciA? /Λ3/7 ?ο Β21 -3具有Ρ比啶降解作用， 其生长速度快、长势好、稳定期长，同时在降解过程中对高浓度底物有较强的耐受性，遗传 稳定性好，降解率高。
[0010] 本发明还提供了一种降解废水中吡啶的方法，将保藏名称为全食副球菌Β21-3的 种子液加入到含有吡啶的废水中，于pH值为6-8、20-42°C的条件下静置或振荡降解2-4天； 所述全食副球菌（/bracocciA? /Λ3/7?ο?7?/7Α?/6·)Β21-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏日期为2015年10月9日，保藏编号为CGMCC Ν0. 11474 ;保藏地址 是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0011] 本发明所述的降解废水中吡啶的方法中使用的全食副球菌B21-3的种子液的菌 种优选为全食副球菌B21-3经过浓度由100mg/L逐渐增大到1000mg/L的吡啶驯化后的菌 种。
[0012] 本发明更为优选的降解方式为振荡降解，振荡速率为180rpm。
[0013] 本发明提供的降解废水中吡啶的方法中所述全食副球菌B21-3的种子液是将菌 株全食副球菌B21-3或高浓度的吡啶驯化后的菌株全食副球菌B21-3接种于LB液体培养 基，30°C，180 r/min培养2d，将培养液在10000 r/min转速下离心5 min，弃去上清液，洗涤 菌体2-3次，将菌体重悬于无机盐液体培养基中，即得种子液；特别地，当所述废水中吡啶 的浓度优选为< l〇〇mg/L，所述驯化后的全食副球菌B21-3的种子液每mL的悬浮液中的活 性菌为10s个，其接种量为含吡啶废水重量的8-10% ;在优选降解温度为25-32°C，更优选为 32°C ;优选pH值为7时，其菌株对吡啶的降解率可达90%以上。
[0014] 本发明提供的降解废水中吡啶的方法，操作简单，不仅能够将废水中的吡啶高效 分解掉，而且不会造成进一步的污染，有效解决了现有技术中处理废水中吡啶的需要专门 的处理设备、成本高以及存在安全隐患的问题。
【附图说明】
[0015] 图1为筛选的全食副球菌B21-3的平板菌落图。
[0016] 图2为筛选的全食副球菌B21-3的革兰氏染色图。
[0017] 图3为温度对全食副球菌B21-3生长的影响。
[0018] 图4为温度对全食副球菌Β21-3降解吡啶的影响。
[0019] 图 5 为 pH 对全食副球菌（/taracocciAS1 B21-3 生长的影响。
[0020] 图6为pH对全食副球菌（/^aracocciA? jOaoioiro/^iAs·) B21-3降解吡啶的影响。
[0021] 图7为驯化和未驯化的全食副球菌（/^aracocciA? jOawioiro/^iAs·) B21-3降解P比啶 的结果。
[0022] 图8为菌株连续传代15代对全食副球菌（/^aracocciA? /Λ3/7?ο?7?/7Α?/6·)Β21-3降解 吡啶的影响。
【具体实施方式】
[0023] 下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
[0024] 实施例 1 :全食副球菌（/^aracocciA? Β21-3 的筛选。
[0025] (1)培养基的配制 无机盐培养基的配制：先称取 NaH2P04 1. 42 g、ΚΗ2Ρ04 1. 36 g、MgS04 · 7H20 0. 216 g、 CaCl2 0.006 g，混合，得无机盐混合物；按如下配方配制微量元素混合液：MnS04*H20 1.69 g/L，CoCl2 · 6H20 0· 24 g/L，Η3Β301· 16 g/L，Na2Mo04 · 2H20 0· 024 g/L，FeS04 · 7H20 2. 78 g/L，ZnS04 · 7H20 1. 15 g/L，CuS04 · 5H20 0. 38 g/L ;吸取 1 mL 微量元素混合液加入到无机 盐混合物中，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7. 0-7. 2,经有机滤膜（0. 22 μ m)过滤除菌后即得 无机盐培养基。
[0026] 吡啶无机盐培养基的配制：在上述无机盐培养基加入吡啶，使培养基中吡啶含量 为 100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 mg/L，经有机滤膜（0· 22 μπι)过滤除 菌后即得吡啶无机盐培养基。
[0027] (2)菌株的分离：采集石家庄某污水处理厂曝气池的活性污泥10 g，加入到100 mL 吡啶含量为100 mg/L的吡啶无机盐培养基中，在30°C、180 r/min培养5 d后，吸取5 mL 的培养液，转接至相同浓度的吡啶无机盐培养基中，连续转接3次；用生理盐水将富集后的 培养液进行梯度稀释，分别稀释至10 4、10 5、10 6倍，充分震荡，再从每个浓度的稀释液中分 别吸取200 μ L菌悬液，涂布于吡啶无机盐培养基中，每个浓度设置三个平行，在恒温生化 培养箱中30Γ培养，挑取颜色、大小不同的单菌落划线纯化，斜面保存； (3)菌株的筛选：将分离纯化的菌株接种至吡啶无机盐培养基中，摇床180 r/min，30°C 震荡培养3 d;吸取适量菌悬液于1.5 mL离心管中，10000 r/min离心8 min，吸取上清，采 用紫外分光光度法进行吡啶含量的定量测定，挑取吡啶降解率高于50%的菌株，即获得所 述全食副球菌（ParacocciA? B21-3。以未接种任何菌株的吡啶无机盐培养 基为对照。
[0028] 降解率计算公式为：降解率=[(对照吸光值-样品吸光值）/对照吸光 值]X 100% 实施例2全食副球菌Β21-3的鉴定 (1)菌株形态观察及革兰氏染色鉴定： 菌落及菌株观察：全食副球菌（ParacocciA? B21-3在LB培养基30 °C 培养48h，观察其菌落呈淡粉色，表面粘质，边缘整齐，易挑起；细胞形态为球形，不产芽孢， 无鞭毛。平板菌落图如图1所示。
[0029] (2)生理生化检测： 根据《常见细菌鉴定手册》中属、种鉴定的相关内容进行了氧化酶、接触酶测定，VP试