一种芽孢杆菌、利用芽孢杆菌生产纤溶酶的方法及纤溶酶在溶栓药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于发酵工程和生物制药技术领域，具体地说，涉及一种枯草芽孢杆菌、利 用该菌制备纤溶酶的方法及纤溶酶在溶栓药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 血栓病是一类严重危害人类健康和生命的疾病，据估计，全世界有血栓病患者约 1500万人，其中每年死于心脑血栓疾病的就高达1200万人，据世界卫生组织（WHO)统计， 由于心肌梗死、脑溢血等血栓性疾病导致的死亡已占到全球总死亡人数的51%，在我国，随 着人们生活水平和生活方式的改变，膳食中高脂肪、高蛋白的过量摄取，血栓性疾病已超过 癌症和糖尿病成为第一大健康杀手。治疗血栓病的药物根据其不同的作用机制可分为： 一、纤溶酶原激活剂，如尿激酶（UK)组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂（tPA)等通过激活血 液中的纤溶酶原来降解纤维蛋白；二、纤维蛋白酶，如蚓激酶、多种蛇毒抗栓酶等，直接降 解血液中的纤维蛋白。微生物一直都是纤溶酶的重要来源，尤其芽孢杆菌属细菌，已经分 离到数十种不同类型的纤溶酶，如分离自Bacillus Subtilis的NK,分离自Bacillus amyloliquefaciens 的 DC4 等，其他如 Bacillus subtilisin Carlsberg， Bacillus cereus等细菌均有报道分离到纤溶酶(在Peng, Yong, Xiaojuan Yang, and Yizheng Zhang. ''Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo.^ Applied microbiology and biotechnology 69.2 (2005): 126-132 有报道），但利用 Bacillus tequilensis 来分离制 备纤溶酶却一直未见报道。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，旨在提供一种新型芽孢杆菌 以及利用该芽孢杆菌进行纤溶酶生产的方法，还包括该纤溶酶在在溶栓药物中的应用。
[0004] 本发明所述芽孢杆菌所采用的技术方案是，该菌株命名为 ie识/iJeasis，其保藏编号为：CGMCC No. 11462。
[0005] 利用上述芽孢杆菌进行纤溶酶生产的方法包括以下步骤：将菌种芽孢杆菌 (SaciWys (其保藏编号为：CGMCC No. 11462)进行发酵培养，从发酵产物中 分离纯化得到芽孢杆菌纤溶酶。
[0006] 进一步地，所述芽孢杆菌分离自土壤，在完成发酵后，进行如下步骤： (1) 发酵液或固体发酵产物洗脱液中加入75%硫酸铵完全沉淀蛋白； (2) 溶解沉淀，经透析去掉残余硫酸铵分子； (3) 透析结束后以MonoQ强阴离子层析，用NaCl洗脱，收集活性部分； (4) 所得具有活性的纤溶酶经Sepcryal -100凝胶柱层析，收集活性峰，冻干后得到纯 度高于90%的纤溶酶，SDS-PAGE电泳呈单一条带。
[0007] 更进一步地，在发酵过程中，采用的是液体培养基，该液体培养基为：按比例称取 大豆及MgCl2，添加双蒸水，置于200 ml烧杯中，121°C，20 min灭菌，待冷却得培养基，其 中的大豆、]\%(：12及双蒸水的质量/质量/体积比为w/w/v=10:l:5 ;或者称取蛋白胨：酵母 粉：氯化钠：氯化镁（2:1:2:1)的重量溶于100倍体积（w/v)的蒸馏水中，分装在于200 ml、l/3装液量的三角瓶中，121°C，20 min灭菌，待冷却得培养基。
[0008] 利用上述方法制备得到的纤溶酶在溶栓药物中的应用，所述纤溶酶在溶栓药物中 用于激活血液中的纤溶酶原来讲解纤维蛋白。
[0009] 本发明的有益效果是：本发明方法制备得到的酶可以直接、迅速降解纤维蛋白，具 有良好的血栓溶解作用，分子量较尿激酶小，引发人体免疫反应风险较低，具有开发成临床 药物的重要价值。同时，该酶的生产原材料丰富，成本低廉，制备工艺简单，易放大实现工业 化生产，是一种可用于膳食补充剂和药物的重要溶栓成分。
【附图说明】
[0010] 图1为制备所得高纯度酶经SDS-PAGE电泳后呈单一条带； 图2为使用纤维平板法测定酶活性，经2h后该纤溶酶所产生的纤溶圈。
【具体实施方式】
[0011] 下面，以具体的实施例对本发明作更进一步的说明。
[0012] (-）芽孢杆菌的分离制备 将采自广东省珠海市的土壤样品，经无菌水稀释，静置取上清，稀释后采用涂板法用纤 维蛋白培养基进行筛选分离(每升培养基含蛋白胨：5g，酵母粉：2g，技术琼脂：18g，脱 脂牛奶：250 ml )，能够在纤维蛋白平板上形成透明圈的菌种单独挑出进一步培养。
[0013] 对于第一步培养的细菌采用改进后的纤维蛋白平板(纤维蛋白原：5g，硫酸铵： 2g，CaCl2: lg，K2HP04:0.1g，KH2P04:0.1g，MgS0 4: 0.2g)进行复筛，对于能够在次形成 透明圈的菌株进行培养保存。
[0014] (二）选取形成透明圈直径最大的菌株，提取其16s rDNA进行测序，测序结果在 NCBI数据库中进行比对，16s rDNA信息为该菌株鉴定的主要依据。其中，在测序中，正向引 物为 27f :5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ；反向引物 1492r :5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
[0015] (三）纤溶酶的制备 实施例一： 称取20克大豆及2 g MgCl2，添加双蒸水10 ml，置于200 ml烧杯中，121°C，20 min 灭菌，待冷却后，接种一环Bacillus tequilensis菌种。32°C，72 h发酵。
[0016] 发酵完成后将200 ml无菌水加入培养基，搅拌0.5 h，4层纱布过滤除去菌体及 不溶性杂质，其余杂质可使用11500 rpm，20 min离心除去。缓慢加入112 g固体硫酸铵， 搅拌均匀，4°C静置1 h，待酶完全沉淀。
[0017] 沉淀加入45 ml Na2C03/NaHC03(30 mM pH 9.2)溶液完全溶解，使用分子量为5 kDa或8 kDa的透析袋在Na2C03/NaHC03 (30 mM pH 9. 2)溶液中进行