用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种抗青霉素结合蛋白ΡΒΡ2α的单克隆抗体，以 及一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌，自从上世纪40年代青霉素问 世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的控制，但随着青霉素的广泛使用，有些 金黄色葡萄球菌产生青霉素酶，能水解内酰胺环，表现为对青霉素的耐药。科学家研究 出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林（methicillin)。1959年应用于临 床后曾有效地控制了金黄色葡萄球菌产酶株的感染，可英国的Jevons就首次发现了耐甲 氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA)，MRSA从发现至今感染几乎遍及全球，已成为院内和社区感 染的重要病原菌之一。MRSA耐药性的产生与一种青霉素结合蛋白（PBP)有关。五种PBP(1， 2,3,3'和4)，它们具有合成细菌细胞壁的功能。它们与β-内酰胺类抗生素有很高的亲 和力，能共价结合于β -内酰胺类药物的活动位点上，失去其活性导致细菌死亡，而MRSA 产生了一种独特的PBP，这种分子量增加了 78~1000道尔顿的PBP，因其电泳率介于PBP2 与PBP3之间，故称为PBP2 α。PBP2 α对β -内酰胺类抗生素亲和力很低，因而很少或不被 β -内酰胺类药结合。在β -内酰胺类抗生素存在的情况下，细菌仍能生长，表现出耐药性。 ΡΒΡ2α的产生是受染色体甲氧西林耐药基因 （mec Α)来调节的。MRSA与MSSA根本区别在 于它们的PBP不同。
[0003] MRSA的不均一耐药性，给其检测带来一定的困难。MRSA的检出率受孵育温度、时 间、培养基的pH和NaCl的浓度、菌液的数量等多种因素的影响。因此，目前还没有一种最 佳的检测方法。
[0004] MRSA感染的治疗是临床十分棘手的难题之一，关键是其对许多抗生素有多重耐 药。因其耐药机制是PBPs (青霉素结合蛋白）性质的改变，因此，MRSA几乎对所有的β-内 酰胺类抗生素耐药，且在同时，还可能对大环内酯类抗生素、氨基糖苷类抗生素等多种抗菌 药物表现出耐药性。因此急需一种可抑制MRSA生长的非抗生素类药物。
[0005] 目前检测MRSA的方法主要包括琼脂筛选法和PCR技术。
[0006] 琼脂筛选法是1997年NCCLS推荐的MRSA的确证试验，即MH培养基加 NaCl (40g/ L)加苯唑西林（6 μ g/ml)，将菌液（0. 5麦氏浊度）点种或画线35° C孵育24h，只要平皿 有菌生长，即使一个菌落也是MRSA，该法敏感度为100 %，常用作校正其它方法的标准，尤 其适用于检测抑菌圈直径处于中介度的金黄色葡萄球菌。结果容易判断，但耗时，费力。
[0007] PCR法是指根据金黄色葡萄球菌的mec A基因 DNA序列设计一引物，再裂解提取 被测菌的DNA作为模板，在一定条件下进行扩增，经琼脂糖电泳后在紫外灯下观察有无与 阳性对照菌株（金黄色葡萄球菌ATCC29213)相同的区带。PCR具有较高的灵敏度，只要被 测菌有微量的基因，即出现阳性结果，因此常作为检测MRSA的参考方法。但PCR很灵敏，有 时会因实验室的污染而出现假阳性，为使PCR具有更高的可靠性，必须对其扩增产物进行 探针杂女或测序以提商特异性。而有一些耐药基因是沉默基因，不表达mec A基因广物，有 时会出现假阴性，所以分子生物学方法并非100 %的敏感和特异，加上该法前期处理操作繁 琐，且需要一定的设备。
【发明内容】
[0008] 本发明的第一个目的在于提供一种抗青霉素结合蛋白PBP2 α的单克隆抗体。
[0009] 本发明所述的抗青霉素结合蛋白ΡΒΡ2α的单克隆抗体，是由保藏号为CCTCC NO. C2014128的杂交瘤细胞株ΡΒΡ2 a -4B8-G7-H7所分泌的。该杂交瘤细胞株保藏单位为中 国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址是中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2014年6 月19日。
[0010] 本发明的第二个目的在于提供一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联 免疫试剂盒，该试剂盒能通过本发明所述的抗ΡΒΡ2 α单克隆抗体来检测样本中的耐甲氧 西林金黄色葡萄球菌，具有简便、快捷、实用、灵敏、高效的特点。
[0011] 本发明所述的一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒，包括 酶标板、标本稀释液、包被抗体、检测抗体、检测抗体稀释液、标准品、阳性对照、阴性对照、 洗涤液、底物显色液、终止液；其中，包被抗体为本发明所述的抗ΡΒΡ2 α单克隆抗体；检测 抗体为HRP标记的抗ΡΒΡ2α多克隆抗体。
[0012] 根据本发明所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒的进 一步特征，所述阳性对照为MRSA菌裂解液，所述阴性对照为MSSA菌裂解液。
[0013] 根据本发明所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒的进 一步特征，所述标本稀释液为含1_2%溶菌酶的2〇1111，？!17.4的？85缓冲液。
[0014] 根据本发明所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒的进 一步特征，所述检测抗体稀释液为含2% BSA、4%蔗糖、150mM NaCl的20mM，ρΗ7. 4的PBS缓 冲液。
[0015] 根据本发明所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒的进 一步特征，所述洗涤液为含〇. 5至1 %吐温20的20mM，ρΗ7. 4的PBS缓冲液。
[0016] 根据本发明所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒的 进一步特征，所述底物显色液由底物液Α和底物Β缓冲液构成；底物液Α的配制方法 为：TMB200mg，无水乙醇（或DMSO) 100ml，加双蒸水至1000ml ;底物B缓冲液的配制方法 为：Na2HP0414. 60g，梓檬酸9. 33g，0. 75%过氧化氢尿素6. 4ml，加三蒸水至1000ml，调至 pH5. 0-5. 4 ;将底物液A和底物B缓冲液按1 :1混合即成酶的底物显色液。
[0017] 根据本发明所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒的进 一步特征，所述终止液为2M硫酸溶液。
[0018] 本发明还提供了所述的单克隆抗体的用途，也就是用于制备抑制耐甲氧西林金黄 色葡萄球菌生长的药物的用途。
[0019] 金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌。根据本发明所述的抗青霉素结 合蛋白PBP2CI的单克隆抗体，结合现有的制药方法，可以制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄 球菌生长的药物。
[0020] 本发明的有益效果是：
[0021] (1)本发明所述抗ΡΒΡ2α抗体是经过实验筛选的优选抗体，具有较强的抑制MRSA 生长的活性，可在免疫印迹实验中用于区分MRSA和MSSA，因此可作为ELISA试剂盒中的检 测抗体，用于区分MRSA和MSSA。
[0022] (2)本发明酶联免疫试剂盒操作简单，耗时少，灵敏度高，适合大量样品中耐甲氧 西林金黄色葡萄球菌的快速检测。
[0023] 综上所述，本发明所述的利用抗PBP2 α抗体制备的检测MRSA的ELISA试剂盒，可 特异高效地检测MRSA，区分MRSA和MSSA，在抑制MRSA菌生长方面具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0024] 图1显示抗PBP2 α单抗通过免疫印迹法区别MRSA和MSSA。图1A的检测样品为 细菌裂解液，图1B的检测样品为细菌培养液上清。
[0025] 图2是抗PBP2 α单抗抑制MRSA生长实验曲线图。
[0026] 图3是抗PBP2 α单抗抑制MSSA生长实验曲线图。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1 :ΡΒΡ2α蛋白的制备。
[0028] (1) mecA目的基因的克隆
[0029] PBP2 α蛋白的氨基酸序列ID号为EUE27353。
[0030] mecA基因编码 ΡΒΡ2α 蛋白，其基因序列来源自 JBDL01000002 (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/protein/EUE27353)。
[0031] 根据mecA基因序列，设计两条引物为：
[0032] ATCTTCACCAACACCTAGTT ；
[0033] ATGAAAAAGATAAAAATTGT。
[0034] 通过PCR扩增得到表达mecA目的基因，将载体pET_28a及经过琼脂糖凝胶纯化的 mecA基因片段，用Ncol+Xhol进行双酶切处理，用T4DNA连接酶将纯化后酶切产物连接，得 到重组质粒pET-28a_PBP2 α，并连接产物转化进入大肠杆菌DH5 α，在含有氨苄青霉素的 LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过双酶切/PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序结果表明 重组的mecA片段与设计的序列完全一致。
[0035] (2)ΡΒΡ2α重组蛋白的表达