用于制备具有降低的溶解氧的水平的人白蛋白的方法
【专利说明】用于制备具有降低的溶解氧的水平的人白蛋白的方法
[0001] 描沭
[0002] 本发明涉及用于制备人白蛋白溶液的方法，更具体地，本发明涉及一种方法，所述 方法包括降低所述白蛋白溶液中的溶解氧直到等于或小于〇. 5ppm的浓度的步骤。以本发 明的方法，获得具有与在人血浆中存在的白蛋白的氧化还原态更接近的氧化还原态的人白 蛋白溶液是可能的。
[0003] 人白蛋白是66kDa的非糖基化的蛋白。数量上，它是最重要的血浆蛋白质并 且在正常血衆中其浓度在35g/l和50g/l之间，构成总血衆蛋白的达60 % (Peters T. J. :A11 About Albumin ；Biochemistry, Genetics and Medical Applications. Academic Press,San Diego,1996)〇
[0004] 人白蛋白的结构由具有585个氨基酸的多肽组成，具有约67% α螺旋，不具 有 β 折叠存在(Otagiri M. , Chuang V. T. :Pharmaceutically important pre-and posttranslational modifications on human serum albumin. Bio Pharm Bull2009 年， 32期，527-534页）。人白蛋白包含参与17个二硫键的形成的6个甲硫氨酸残基和35个 半胱氨酸残基。Cys-34是在整个分子中唯一游离的半胱氨酸。人白蛋白由于与多重配体 (multiple ligands)结合的能力和其自由基俘获（radical entrapment)特性而具有特定 的抗氧化功能，与多重配体结合的能力和其自由基俘获特性二者均与其结构紧密相关。
[0005] 尽管存在氧化白蛋白的许多可能性，但是Cys-34是对氧化/还原特别地敏感的位 点。因此，通常，在Cyst-34的方面谈及白蛋白的氧化还原态是合理的。根据Cys-34的氧 化还原态，通过白蛋白的层析分离，获得三种级分（Peters，1996,同前）：
[0006] (i)还原形式，其中半胱氨酸是以游离的硫醇基的形式，被称为人巯基白蛋白 (human mercaptoalbumin, ΗΜΑ)；
[0007] (ii)氧化形式，其中半胱氨酸与小的硫醇化合物，主要是半胱氨酸或半胱氨酰 甘氨酸形成二硫键，尽管也与高半胱氨酸和谷胱甘肽形成二硫键，被称为人非巯基白蛋白 1 (human non-mercaptoalbumin 1, HNA1);以及
[0008] (iii)最高氧化形式，其中半胱氨酸是亚磺酸或磺酸，被称为人非巯基白蛋白 2 (human non-mercaptoalbumin 2, HNA2)〇
[0009] 在健康人中，约50-69%的总白蛋白呈ΗΜΑ的形式，27-42%呈HNA1的形式，以 及 3-5%呈 HNA2 的形式（Oettl K·，等人 Oxidative damage of albumin in advanced liver disease. Biochim.Biophys. Acta 2008年，1782期，469-473 页；Oettl K.和Marsche G. Redox State of human serum albumin in terms of cysteine-34in health and disease. Methods Enzymol. 2010 年，474 期，181-195 页；以及 Oettl K·，等人 Oxidative albumin damage in chronic liver failure:Relation to albumin binding capacity ； liver dysfunction and survival. J Hepatol，2013 年，59 期，978-983 页）。通常人们相 信ΗΜΑ氧化成HNA1是可逆的过程，而ΗΜΑ氧化成HNA2是不可逆的过程。
[0010] 白蛋白在体内和在产生治疗性白蛋白而使用的方期间，可以经历多种结构的修 改，导致其构象的修改，并且结果是，结合特性与其氧化还原态一起的修改（Oettl，Κ.等 人，2010年，同前）。
[0011] 在用于获得纯化的蛋白的人血浆的分级分离中通常使用的方法，其中被用于发现 白蛋白的是 Cohn 法（Cohn E. J.等人，^Preparation and properties of serum plasma proteins, IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. J. Am. Chem. Soc. 1946 年， 68期，459-475页），或其较小的修改。
[0012] Cohn法以人血浆开始，对其进行沉淀和分离的相继步骤。在各自步骤中，获得富 含血衆蛋白之一的沉淀物和倾析上清液（decantation supernatant)。为实现沉淀相继的 Cohn级分（级分I、级分11+111、级分IV和级分V)，以改变不同蛋白质的溶解度的目的，需 要修改溶液的参数，例如，尤其是，PH、介电常数、温度、蛋白质浓度和离子强度。此外，应该 指出的是所述Cohn级分包含递增浓度的乙醇。结果，包含在级分IV的上清液中的白蛋白 以约40% (v/v)乙醇被沉淀，并且继续形成级分V的楽;体（paste)的部分。
[0013] 在获得级分V之后，将后者重悬在溶液中并且对其进行不同步骤直到获得最终产 物。习惯地，这些步骤包括：透析过滤、热处理、灭菌、装入小瓶、以及所述小瓶的最终巴氏灭 菌，随后通常在30-32Γ不少于14天的时间段期间，提交所述小瓶检疫（quarantine)，目的 是保证最终产品的无菌。
[0014] 本发明人已经发现，在从人血浆开始的获得白蛋白溶液的过程期间，白蛋白遭受 对CyS-34的氧化还原态的修改。这些修改从根本上发生在氧存在的储存期间，藉此它们本 质上按照检疫步骤被检测。在若干生产批次（η = 7)中，已经发现ΗΜΑ、HNA1和HNA2的水 平分别是40-53 %、39-44 %和7-16 % (w/v)，并且结果，ΗΜΑ和ΗΝΑ2的水平主要地不同于在 健康人中描述的那些（Oettl K. 2008、2010和2013,同前）。这由于，例如，在HNA2的情形 中，如上文中陈述的向HNA2的氧化是不可逆的过程的事实，而可以是显著重要的。
[0015] 令人意外地，发明人已经发现，通过在产生人白蛋白溶液过程中加入包括降低溶 液中的溶解氧的步骤，其中氧的水平被降至等于或小于〇. 5ppm的浓度，实现Cys-34的氧化 的降低，获得的白蛋白的氧化还原态与在血浆中存在的白蛋白的氧化还原态非常相似。这 导致以下事实：获得的白蛋白的特性，例如，其抗氧化特性，与在血液中存在的白蛋白的那 些特性更相似，这可以导致在其许多应用中其治疗功效的改进。
[0016] 因此，本发明揭示了用于制备人白蛋白溶液的方法，其特征在于它包括降低所述 白蛋白溶液中溶解氧的步骤，其中所述氧的水平被降低至等于或小于〇. 5ppm的浓度。优选 地，在降低白蛋白溶液中溶解氧的步骤之后，所述白蛋白溶液被维持在惰性气体气氛中。
[0017] 所述降低白蛋白溶液中溶解氧的步骤可以以本领域目前已知的多种方式来进行。 优选地，白蛋白溶液的表面处理可以以惰性气体来实现或惰性气体可以被鼓泡进入所述白 蛋白溶液的内部。在本发明的方法中使用的所述惰性气体可以是氮气、氦气或类似的气体。
[0018] 本发明的方法可以被用于获得具有在约4%和25% (w/v)之间的白蛋白浓度的白 蛋白溶液。优选地，获得的白蛋白是治疗性白蛋白。
[0019] 此外，本发明的白蛋白可以是以重组的形式或转基因的形式获得的白蛋白。重组 的白蛋白或转基因的白蛋白的分子在其氨基酸的序列方面与人白蛋白相同，它不存在糖基 化并且，以它是功能性的目的，它必须展示与人血浆来源的白蛋白相同的构象折叠。如果不 是这样，除了由所述差异引起的其他可能副反应以外，由于免疫原性的危险它不能被向人 施用。
[0020] 降低本发明的白蛋白溶液中的溶解氧的步骤可以在所述白蛋白溶液的巴氏灭菌 步骤之前或之后被实行，或此外，尽管所述白蛋白溶液的巴氏灭菌步骤不被实现，它也可以 不依赖于制备最初的白蛋白溶液的过程而被执行。
[0021] 为获得通过本发明的方法获得的白蛋白溶液中Cys-34的氧化还原态方面更好的 结果，优选地，在降低白蛋白溶液中溶解氧的步骤之后，所述白蛋白溶液被维持在惰性气体 气氛中。所述惰性气体气氛可以是氮气、氦气或类似的气体。
[0022] 尽管利用通过本发明的方法获得的白蛋白被包装和/或储存在其中的那些中的 任何容器是可能的，优选的是所述容器是由对氧不渗透的材料制成，更优选的是由玻璃制 成。
[0023] 本发明的另一目的是揭示组合物和其作为药物的用途，所述组合物包含通过本发 明的方法制备的人白蛋白。<