一种穿膜多肽及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及肿瘤相关的药物领域，具体而言，本发明涉及一种 穿膜多肽，以及该多肽与抗肿瘤药偶联形成的偶联物。
【背景技术】
[0002] 脑瘤及脑转移瘤的发病率逐年上升。在对其治疗方面，血脑屏障被认为是阻止化 疗药物进入脑组织进而影响疗效的主要原因。血脑屏障是机体参与固有免疫的内部屏障之 一，由介于血循环与脑实质间的软脑膜、脉络丛的脑毛细血管壁和包于壁外的胶质膜所组 成，能阻挡病原生物和其他大分子物质由血循环进入脑组织和脑室。基本上100%的大分子 药物，包括多肽、重组蛋白、单克隆抗体、基于RNA干扰技术的药物、基因治疗相关药物等都 无法穿越血脑屏障，且大于98%的小分子药物也无法穿过血脑屏障。目前，放射性治疗与 化学疗法只能延长患者生命4个月，因此本发明致力于研究使现有药物更好的透过血脑屏 障。
[0003] 多肽由于其具有极性末端和非极性末端，因此在体内有较高的利用度，由于本身 是内源性物质所以毒性小，但是多肽直接作为药物受到较大的限制，例如其稳定性差，不能 口服。近年来，多肽作为药物辅助功能的应用逐渐成为了新药研制的热点之一。细胞穿膜肽 是20世纪中期开始认识到的一类具特殊功能的多肽分子，英文学术名称一般写为cell2-p enetrating-peptides (CPPs)。它们通常由5~30个氨基酸组成，典型的一般由8~16个氨 基酸构成，具有生物膜穿透功能，还可携带其它分子甚至超分子颗粒进入细胞中。正是因为 这种特殊的功能，它们被看作生物活性分子有效的细胞内转运工具，具有广泛的应用前景。
[0004] 近些年来多肽和药物通过共价方式形成组合物的例子很多，例如：多肽 Penetratin和阿霉素共价耦合用于治疗乳腺癌；多肽TAT和药物P53共价耦合用于治疗眼 癌转移；多肽YTA4与甲氨蝶呤共价耦合治疗乳腺癌。
【发明内容】
[0005] 以下是本发明的详细描述：
[0006] (1)本发明所述的穿膜肽
[0007] 本发明所述的细胞穿膜肽，由13个氨基酸组成，而且是亲水性和疏水性交替组合 的，氨基酸序列为：
[0008] RGGRVRRRWRGGR
[0009] 该多肽本身不具有生理活性，但是具有透过血脑屏障的作用，本发明还涉及该多 肽的制备方法及其应用。
[0010] (2)本发明所述的穿膜肽的制备方法
[0011] 本发明所需多肽是采用固相的方法制备的，固相合成是以固相载体树脂为载体， 从C端即羧基端向N端即氨基端逐渐添加氨基酸的过程。
[0012] 本发明中优选树脂：Fmoc-wang树脂、2-cl-trt树脂，树脂取代度0. 24~0. 4.
[0013] 本发明所使用的保护氨基酸为：Fmoc-Arg(pbf)-〇H，Fmoc-Gly-〇H，Fmoc-Val-〇H, Fmoc-Trp-OH，反应过程中保护氨基酸3~5倍过量。
[0014] 本发明所使用的脱保护试剂为：哌啶/N，N-二甲基甲酰胺，比例为10:90~ 30:70。
[0015] 本发明所使用的偶联试剂为：①苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸盐 /1-羟基苯并三唑（Η0ΒΤ)，②2-(7-偶氮苯并三氮唑）-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯 /1-羟基苯并三唑（Η0ΒΤ)，③Ν，Ν'_二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑（Η0ΒΤ)。
[0016] 本发明中，若使用第①或者第②种偶联试剂，那么反应中过程中应添加缚酸剂： DIEA/NMP。
[0017] 本发明中所使用的切割试剂为：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1，2-乙二硫醇，比例 为：82· 5:5:5:5 ;2· 5〇
[0018] 本发明中所使用MS-IT-T0F确定分子量，使用HPLC纯化粗肽
[0019] (3)本发明所述多肽与抗肿瘤药物阿霉素的连接方法
[0021] 1)化合物II的合成
[0022] 50m 反应瓶中加入 1. 0g(l. 72mmol)阿霉素，0· 52g(5. 20mmol) 丁二酸酐，30mlTHF， 滴加0. 66g(5. 12mmol)N，N-二异丙基乙胺（DIEA)，27°C搅拌6h，蒸干溶剂得蜡状物，加水搅 拌，有黄色固体析出，抽滤，水洗两次，干燥，得黄色固体1. 15g。
[0023] 2)化合物I的合成
[0024] 50m 反应瓶中加入 0· 22g(0. 32mmol)化合物 ΙΙ，0· 10g(0. 31mmol)0-苯并三氮 唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU)，5mlDMF，氮气保护，滴加0. 08g(0. 62mmol) N，N-二异丙基乙胺（DIEA)，27°C搅拌lh后，加入0. 10g多肽，27°C搅拌3h后，终止反应。使 用MS-IT-T0F确定分子量，使用HPLC纯化粗产物。
[0025] (4)本发明所述多肽与抗肿瘤药物紫杉醇的连接方法
[0026]
[0027] 1)化合物III的合成
[0028] 50m 反应瓶中加入 1. 50g(l. 72mmol)紫杉醇，0· 52g(5. 20mmol) 丁二酸酐， 30mlTHF，滴加0. 66g(5. 12mmol)N，N-二异丙基乙胺（DIEA)，27°C搅拌6h，蒸干溶剂得蜡状 物，加水搅拌，有黄色固体析出，抽滤，水洗两次，干燥，得黄色固体1. 15g。
[0029] 2)化合物IV的合成
[0030] 50m 反应瓶中加入 0· 22g(0. 32mmol)化合物 ΙΙΙ，0· 10g(0. 31mmol)0-苯并三氮 唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU)，5mlDMF，氮气保护，滴加0. 08g (0. 62mmol) N，N-二异丙基乙胺（DIEA)，27°C搅拌lh后，加入0. 10g多肽，27°C搅拌3h后，终止反应。使 用MS-IT-T0F确定分子量，使用HPLC纯化粗产物。
【附图说明】
[0031] 图1为合成多肽的HPLC测试结果图。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0033] 在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0034] 实施例1:多狀的固相合成
[0035]