通过阳离子交换层析进行的抗体纯化的利记博彩app
【专利说明】通过阳离子交换层析进行的抗体纯化
[0001] 本申请是申请日为2008年10月29日、中国申请号为201310495290. 7、发明名称 为"通过阳离子交换层析进行的抗体纯化"的发明分案申请的再分案申请（原申请申请号 200880119331. X)。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求2007年10月30日提交的美国临时专利申请No. 60/983825的权益， 通过述及将其公开内容完整收入本文用于所有目的。 发明领域
[0004] 一般而言，本发明涉及蛋白质纯化。具体而言，本发明涉及一种使用阳离子交换层 析自包含抗体和至少一种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，其中在使用电导率升高的 洗脱缓冲液来洗脱期望抗体之前使用高pH清洗步骤来清除污染物。
[0005] 发明背景
[0006] 大规模的、经济的蛋白质纯化日益成为生物技术产业的重要问题。一般而言，通过 细胞培养来生产蛋白质，使用通过插入含有感兴趣蛋白质的基因的重组质粒而改造成生成 该蛋白质的真核或原核细胞系。由于通常所使用的细胞是活的有机体，因此必须给它们进 料含有糖、氨基酸、和生长因子（通常自动物血清的制备物来供应）的复合生长培养基。将 期望的蛋白质与进料给细胞的化合物混合物及与细胞自身的副产物分开至足以用作人治 疗剂的纯度提出了艰难的挑战。
[0007] 用于自细胞碎肩纯化蛋白质的规程首先取决于蛋白质表达的部位。一些蛋白质能 自细胞直接分泌入周围的生长培养基中，其它蛋白质是胞内制备的。对于后一类蛋白质，纯 化过程的第一步涉及裂解细胞，这可以通过多种方法来进行，包括机械剪切、渗压震扰、或 酶处理。此类破坏将细胞的整个内含物释放入匀浆中，而且另外生成由于尺寸小而难以清 除的亚细胞碎片。这些一般通过差速离心或通过过滤来清除。由于蛋白质生成运行的过程 中细胞的天然死亡和胞内宿主细胞蛋白质的释放，直接分泌的蛋白质存在同样的问题，只 是程度较小。
[0008] -旦获得含有感兴趣蛋白质的澄清溶液，通常使用不同层析技术的组合来试图将 它与细胞生成的其它蛋白质分开。这些技术基于蛋白质的电荷、疏水性程度、或大小将蛋 白混合物分开。这些技术每一种可利用数种不同层析树脂，从而容许为所涉及的具体蛋白 质精确剪裁纯化方案。这些分离方法每一种的本质是能使蛋白质以不同速率沿长柱向下移 动，从而实现随它们沿柱进一步向下移动时增大的物理分离，或者是能使蛋白质选择性粘 附至分离介质，然后用不同溶剂差异洗脱。在一些情况中，当杂质特异性粘附至柱而感兴趣 蛋白质不粘附至柱时，将期望蛋白质与杂质分开，也就是说，感兴趣的蛋白质存在于"流出 液"中。
[0009] 离子交换层析是常用于纯化蛋白质的一种层析技术。在离子交换层析中，溶质表 面上带电荷的部分（patch)受到附着于层析基质的相反电荷的吸引，前提是周围缓冲液的 离子强度低。一般通过提高缓冲液的离子强度（即电导率）以与溶质竞争离子交换基质带 电荷的位点来实现洗脱。改变pH，由此改变溶质的电荷是实现溶质洗脱的另一种方式。电 导率或pH的变化可以是逐渐的（梯度洗脱）或逐步的（分步洗脱）。在过去，这些变化是 渐进的；即，pH或电导率以单一方向升高或降低。
[0010]美国专利 No. 6, 339, 142 ;6, 417, 355 ;6, 489, 447 ;和 7, 074, 404(Basey et al.)记载了用于纯化多肽的离子交换层析。美国专利No. 6, 127,526 ;6, 333, 398 ;和 6, 797, 814 (Blank，G.)记载了通过蛋白A层析来纯化蛋白质，诸如抗HER2抗体。美国申请 公开No. 2004/0082047中记载了通过离子交换层析来纯化蛋白质（诸如抗体）的方法。 [0011] 美国专利No. 5, 110, 913涉及通过于第一 pH 4. 6使抗体结合至离子交换树脂， 于第二pH 5. 5清洗，并于pH 6. 5洗脱抗体来纯化水溶液中的抗体，其中这三个步骤的溶 液的离子强度保持恒定。Zhang et al.涉及人抗体的Q膜、阴离子交换层析（Zhang et al. "Q Membrane Chromatography Application for Human Antibody Purification Process,'，Poster presented at BioProduction, Oct. 26-27. Munich, Germany, 2004) 〇 其它关注蛋白质纯化的出版物包括：Barnthouse et al.J. Biotech. 66:125-136 (1998); Blank et al.Bioseparation 10:65-71 (2001) ；Fo 11 man and Fahrner J. Chromatog. 1024:79-85(2004) ； Iyer et al. BioPharm 15 (1) : 14-16, 18, 20, 53 (2002)； US 2004/0082047A1 ；EP 333, 574 ；EP 460,426 B1 ；EP 556, 083 ；W0 89/05157 ；W0 92/22653 ；W0 93/06217 ；W0 95/22389 ；W0 96/33208 ；W0 96/40883 ；US 4,753,894； US 4, 966,851；US 5, 110,913；US 5, 112,951；US 5, 115, 101；US 5, 118,796；US 5, 169, 774；US 5, 196, 323 ；US 5, 256, 769 ；US 5, 279, 823 ；US 5, 429, 746 ；US 5,451,662； US 5, 525, 338 ；US 5, 677, 171 ；US 6, 005, 081 ；US 6, 054, 561 ；US 6, 127, 526 ；US 6, 267, 958；US 6, 339, 142 ；US 6, 417, 335 ；US 6, 489, 447 ；Adachi et al. , Journal of Chromatography. A. 763 (1-2) :57-63 (Feb 28,1997) ；Gagnon,P. , Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Tucson:Validated Biosystems, Inc. , Chapter 4,pps. 57-86 (1996) ；Graf et al., Bioseparation 4 (1) :7-20(Feb 1994)； Mhatre et al. , Journal of Chromatography A 707(2):225-231 (Jul 21,1995)； Neidhardt et al., Journal of Chromatography 590 (2):255-261 (1992) ；Protein Purification Applications-APractical Approach,Harris and Angal,IRL Press pps.151-156 (1995) ；Sofer et al. Handbook of Process Chromatography: A Guide to Optimization, Scale-up, and Validation, San Diego:Academic Press pps. 65-80(1997)； Tishchenko et al. , Journal of Chromatography B 706 (1):157-166 (Feb 27,1998)〇
[0012] 发明概述
[0013] 本文中的发明关注一种用于抗体阳离子交换层析的改良方法，其中在洗脱期望抗 体产物之前使用高pH清洗步骤来清除污染物。过程结果导致中国仓鼠卵巢蛋白质（CHOP) 污染物的清除得到改进等。
[0014] 依照第一个方面，本发明提供了一种用于自包含抗体和至少一种污染物的组合物 纯化所述抗体的方法，该方法包括下述按序步骤：
[0015] (a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于第一 pH ;
[0016] (b)用pH大于（a)中所述组合物的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料，其 中所述第一清洗缓冲液的pH为约6. 8至约9. 0 ;
[0017] (c)用pH小于所述第一清洗缓冲液的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料； 并
[0018] (d)用电导率显著（substantially)大于所述第二清洗缓冲液的洗脱缓冲液自所
[0019] 述阳离子交换材料洗脱所述抗体。
[0020] 优选的是，所述抗体结合人CD20,诸如利妥昔单抗（rituximab)，或结合人血管内 皮生长因子（VEGF)，诸如贝伐单抗（bevacizumab)。
[0021] 依照一个优选的实施方案中，本发明关注一种用于自包含结合人CH20的抗体和 一种或多种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，所述污染物选自下组：中国仓鼠卵巢蛋 白质（CHOP)、浸出的（leached)蛋白A、DNA、和聚集的⑶20抗体，该方法包括下述按序步 骤：
[0022] (a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于约4. 0至约6. 0 的pH;
[0023] (b)用pH约6. 8至约9. 0的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料，其中所述 第一清洗缓冲液的pH为约6. 8至约9. 0 ;
[0024] (c)用pH约5. 0至约6. 0的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；并
[0025] (d)用pH约5. 0至约6. 0且电导率约10mS/cm至约100mS/cm的洗脱缓冲液自所 述阳离子交换材料洗脱所述抗体。
[0026] 优选的是，所述CD20抗体是利妥昔单抗。
[0027] -种另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种用于自包含结合人血管内皮生长 因子（VEGF)的抗体和一种或多种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，所述污染物选自 下组：细胞培养基成分、硫酸庆大霉素（Garamycin)、中国仓鼠卵巢蛋白质（CH0P)、DNA、病 毒污染物、和聚集的VEGF抗体，该方法包括下述按序步骤：
[0028] (a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于约4. 0至约6. 0 的pH;
[0029] (b)用pH约6. 8至约8. 0的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；
[0030] (C)用pH约5. 0至约6. 0的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；并
[0031] (d)用pH约5. 0至约6. 0且电导率约10mS/cm至约100mS/cm的洗脱缓冲液自所 述阳离子交换材料洗脱所述抗体。
[0032] 优选的是，所述VEGF抗体是贝伐单抗。
[0033] 本发明还关注一种组合物，其在包含约25mM HEPES、pH约7. 8的缓冲液中包含利 安昔单抗。
[0034] 另外，本发明提供了一种组合物，其在包含约25mM MOPS、pH约7. 0的缓冲液中包 含贝伐单抗。
[0035] 本发明涉及下述各项。
[0036] 1. 一种用于自包含抗体和至少一种污染物的组合物纯化所述抗体的方法，该方法 包括下述按序步骤：
[0037] (a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于第一 pH ;
[0038] (b)用pH大于（a)中所述组合物的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料，其 中所述第一清洗缓冲液的pH为约6. 8至约9. 0 ;
[0039] (c)用pH小于所述第一清洗缓冲液的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料； 并
[0040] (d)用电导率显著大于所述第二清洗缓冲液的洗脱缓冲液自所述阳离子交换材料 洗脱所述抗体。
[0041] 2.项1的方法，其中所述第二清洗缓冲液的pH和所述洗脱缓冲液的pH大致相同。
[0042] 3.项1的方法，其中所述抗体结合人⑶20。
[0043] 4.项1的方法，其中所述抗体结合人血管内皮生长因子（VEGF)。
[0044] 5.项1的方法，其中（a)中所述组合物的pH为约4. 0至约6. 0,所述第一清洗缓 冲液的pH为约6. 8至约8. 0,所述第二清洗缓冲液的pH为约5. 0至约6. 0,而所述洗脱缓 冲液的pH为约5. 0至约6. 0。
[0045] 6.项1的方法，其中所述洗脱缓冲液的电导率为约10mS/cm至约100mS/cm。
[0046] 7.项1的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约100至约300mM NaCl。
[0047] 8.项1的方法，其中所述阳离子交换材料包括经磺丙基官能化多羟基化聚合物包 被的交联聚（苯乙烯-二乙烯基苯）流通颗粒。
[0048] 9.项1的方法，其中所述污染物选自下组：中国仓鼠卵巢蛋白质（CHOP)、浸出的蛋 白A、DNA、聚集的抗体、细胞培养基成分、硫酸庆大霉素、和病毒污染物。
[0049] 10.项1的方法，进一步包括在步骤（a)至（d)之前、期间、或之后将包含所述抗体 的组合物进行一个或多个进一步的纯化步骤以获得所述抗体的均质制备物。
[0050] 11.项10的方法，进一步包括将纯化的抗体与异源分子偶联。
[0051] 12.项10或11的方法，进一步包括通过组合所述抗体的均质制备物或所述偶联的 抗体与医学可接受载体来制备药物组合物。
[0052] 13. -种用于自包含结合人CH20的抗体和一种或多种污染物的组合物纯化所述 抗体的方法，所述污染物选自下组：中国仓鼠卵巢蛋白质（CHOP)、浸出的蛋白A、DNA、和聚 集的CD20抗体，该方法包括下述按序步骤：
[0053] (a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于约4. 0至约6. 0 的pH;
[0054] (b)用pH约6. 8至约9. 0的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料，其中所述 第一清洗缓冲液的pH为约6. 8至约9. 0 ;
[0055] (c)用pH约5. 0至约6. 0的第二清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；并
[0056] (d)用pH约5. 0至约6. 0且电导率约10mS/cm至约100mS/cm的洗脱缓冲液自所 述阳离子交换材料洗脱所述抗体。
[0057] 14.项13的方法，其中所述抗体是利妥昔单抗。
[0058] 15.项13的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约100至约300mM NaCl。
[0059] 16. -种用于自包含结合人血管内皮生长因子（VEGF)的抗体和一种或多种污染 物的组合物纯化所述抗体的方法，所述污染物选自下组：细胞培养基成分、硫酸庆大霉素、 中国仓鼠卵巢蛋白质（CHOP)、DNA、病毒污染物、和聚集的VEGF抗体，该方法包括下述按序 步骤：
[0060] (a)将所述组合物加载到阳离子交换材料上，其中所述组合物处于约4. 0至约6. 0 的pH;
[0061] (b)用pH约6. 8至约8. 0的第一清洗缓冲液清洗所述阳离子交换材料；