一种猪肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种针对猪肉源性成分核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对猪肉源 性成分核酸的现场快速定性检测。 (二）
【背景技术】
[0002] 近年来，肉制品掺假成为社会广泛关注的食品安全问题。2013年，涉及欧洲16国 的"马肉风波"震惊整个欧洲。在我国，肉类掺假掺杂事件近年来被媒体多次曝光。肉制品 市场中，一些不法商家或个人为了追求自身利益而用低价劣质的肉冒充高价优质的肉，以 猪肉冒充牛羊肉等，极大的损坏了消费者的利益和健康。
[0003] 目前，普通PCR或实时荧光定量PCR是肉制品品种鉴别最常用的方法，普通PCR法 具有耗时长，操作繁琐，灵敏度不够，容易产交叉污染等缺点。实时荧光PCR法则具有成本 昂贵，耗时长，技术要求高，需要大型的仪器设备等缺点，因此其应用仍存在一定的局限性。 恒温扩增技术是继PCR技术后近年发展起来的一种新的体外核酸扩增技术，本发明技术研 制了恒温扩增猪肉源性成分核酸，并结合核酸试纸条显色来判定检测结果，且整个反应过 程不打开反应管盖子，试纸条流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。 研究表明该猪肉源性成分核酸恒温扩增-核酸试纸条检测方法具有特异性强、敏感度高、 对仪器要求简单、检测时间短等优点，所以非常适用在基层检验机构使用，同时在农贸市场 的现场检测上也具有很好的应用前景。 (三）
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测猪肉源性成分核酸的恒温扩增检 测试剂盒及其检测方法。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种猪肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下 组成：
[0007] (1)恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩 增引物、lXThermolbuffer、MgS04、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：
[0008] 所述的外围引物分别为：
[0009]所述正向外围引物为：5' -TGAAACATTGGAGTAGTCCTAC-3'(SEQIDN0.2);
[0010] 反向外围引物为：5' -AGAATCGTGTGAGGGTTG-3'(SEQIDNO. 3);所述两条探针 的序列分别为：
[0011] 正向 5，端Biotin标记探针：5，-Biotin-GCAGGACGTAGCCTATGAA-3，（SEQID NO. 4)；
[0012] 反向 5 '端Fite标记探针：5 ' -Fitc-ACAGACCTCGTAGAATGAATCT-3 '(SEQID NO. 5)；
[0013] 所述两条扩增交叉引物分别为：
[0014] 扩增正向引物：5'-
[0015]GCTCCTCAGAATGATATTTGTCCTCATTTACCGTTATAGCAACAGC-3r(SEQIDNO. 6)；
[0016] 扩增反向引物：5'-
[0017] ACTATCAGCTATCCCTTATATCGGATTTGTCGACGGAAAAGCC-3 ,
[0018](SEQIDNO. 7)；
[0019] (2)阳性对照：含有猪属特异性的Cytb基因片段的DNA质粒；
[0020] ⑶阴性对照：无菌双蒸水。
[0021] 进一步，本发明所述的 1XThermolbuffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的 KCl、10mM的（NH4)2S04、2mM的MgS04&及质量浓度为 0.1% 的TritonΧ-100，ρΗ7·8。
[0022] 进一步，本发明所述阳性对照为含有长198bp的猪属特异性的Cytb基因序列的片 段，所述片段的核苷酸序列如下（SEQIDNO. 1):
[0024] 进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：
[0025] 以包含扩增区域的猪属特异性的Cytb基因片段为模板，通过两条外围引物进行 PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒（Promega)对PCR扩增产物进行纯化；将纯 化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒（Promega)构建完整的含有目的基因的质 粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A2S。定量并稀释至10个拷贝/μ1，获得阳性对 照，-20 °C保存。
[0026] 进一步，本发明所述恒温扩增反应液组成为：两条外围引物各自5. 7nmol，两条探 针各自 11. 4nmol，两条交叉引物各自 22. 8nmol，IXThermolbuffer，]\%304为 0.2μmol， dNTPs溶液各35pmol，BstDNA聚合酶8U，无菌双蒸水组成补足至25μ1。
[0027] 本发明还提供一种所述猪肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒的检测方法，所 述检测方法为：
[0028]a)提取待检测标本中DNA:剪取约米粒大小的猪肉样品，加入500 μL双蒸水后振 荡15s，于95°C作用5min，离心后取上清，即获得DNA;
[0029] b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在 65°C下扩增反应30分钟；标准阳性模板（即阳性对照）加入阳性对照PCR管中，标准阴性 模板（即阴性对照）加入阴性对照PCR管中，所述标准阳性模板为含有猪属特异性的Cytb 基因片段的DNA质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水；
[0030] c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置（杭州优思达生物技术公 司3号装置）中进行检测，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时（C、T线均为 红色），说明样品中含有猪肉源性成分核酸。该试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序有 样品垫、有色颗粒结合物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检 测线和质控线，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗Fite抗体包被，检测线上有亲和 素包被，质控线上有抗Fite抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。
[0031] 在本发明提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。本试 剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠BstDNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA 合成不断的自我扩增循环。在本发明提供的猪肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒中， 对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg2+浓度，反应温度等的优化，并将本 发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了猪肉源性成分核酸恒温扩增定性检测的方 法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10个拷贝，，可以满足现场快速检测猪肉 源性成分核酸的要求。
[0032] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0033] (1)本发明简化了肉样品核酸的提取方法，减低了成本，而且大大缩短了检测时 间。
[0034] (2)猪肉恒温扩增检测试剂盒的特异性好，灵敏度高，步骤简单，可重复性高；
[0035] (3)反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需40分钟左右；(4)整个扩 增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；整个反应过程不需要 复杂的仪器。 (四）
【附图说明】
[0036] 图1为核酸检测试纸条原理示意图。
[0037] 图2为本发明试剂盒用于检测猪肉源性成分核酸的特异性，图中1-7分别表示猪 肉、鸡肉、鸭肉、牛肉、羊肉、阳性对照品、阴性对照品。
[0038] 图3为本发明试剂盒用于检测猪肉源性成分核酸的灵敏度，图中1-6分别表示10 4 拷贝/微升、1〇3拷贝/微升、102拷贝/微升、10 1拷贝/微升、10 °拷贝/微升、阴性对照品。 (五）
【具体实施方式】
[0039] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0040] 实施例1本发明试剂盒的组成与配制
[0041]a)猪肉源性成分核酸的恒温扩增反应液：两条外围引物（5. 7nmol)，两条探针 (11.4nmol)和两条交叉引物（22.8nmol)，lXThermolbufTer，MgS04(0.2ymol)，dNTPs溶 液（各35pmol)，BstDNA聚合酶（8U)和无菌双蒸水组成，总反应液体积为25μ1 ;
[0042] 所述正向外围引物为：5' -TGAAACATTGG