一种检测肿瘤组织中EGFRvIII的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体来说，涉及一种检测肿瘤组织中EGFRvIII 的方法。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，是我国乃至全世界公关的重点疾病之一，其发 病率有逐渐增加的趋势。近年来的肿瘤学研究和临床观察，发现环境因素与个人行为对人 类肿瘤的发生和发展有着重要的影响。越来越多的研究表明：几乎所有的恶性肿瘤都与外 界所遭受的环境因素有关。各种环境因素以不同的方式造成了有机体遗传物质的损伤，例 如基因的突变、重组等，从而直接或间接的造成原癌基因的激活或者抑癌基因的失活，使细 胞病变、永生化，继而造就了肿瘤的产生。归根结底，肿瘤是一类基因疾病。近年来发展起来 的免疫治疗和细胞治疗针对的就是导致肿瘤产生的特异性的基因，来靶向杀死肿瘤细胞。
[0003] 恶性肿瘤如：胶质细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等的细胞表面有表皮生 长因子受体（EGFR)的过表达和基因的突变或重组，而EGFRvIII(表皮生长因子受体III型 突变体）是表皮生长因子受体（EGFR)最常见的突变体形式。EGFRvIII是EGFR缺失了胞外 段的2-7外显子部分（801bp)，而1和8外显子直接连接，且在连接处形成了一个新的甘氨 酸。较EGFR野生型来说，EGFRvIII缺失了胞外段的6-273号氨基酸残基，S卩EGFR的配体 结合区，其本身不和配体结合，即可产生持续的磷酸化，使受体产生持续的刺激信号。近年 来的研究报道，EGFRvIII通过促进细胞的增殖、迀移和侵袭，降低细胞的死亡来促进肿瘤的 发生和发展。与此同时，EGFRvIII仅表达于肿瘤细胞，而正常细胞中却没有报道，这也是近 年来越来越多的免疫治疗以EGFRvIII为靶向的主要原因。
[0004] 如何准确、快速的检测出各肿瘤组织EGFRvIII的表达情况是靶向免疫治疗的关 键因素，从1962年Montalcini和Cohen等人发现表皮生长因子（EGF)至今，关于其受体 EGFR及相关突变的研究取得了重要的进展，对于EGFR及相关突变体的鉴定也伴随EGF的研 究延续至今。主要采用的方法有直接测序法、实时定量PCR及组织免疫组化等的方法。这 些方法各有优势，但操作复杂、耗时长、成本相对较大一定程度上限制了这些方法的推广使 用。
【发明内容】
[0005] 针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种检测肿瘤组织中EGFRvIII的 方法。
[0006] 为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的： 一种检测肿瘤组织中EGFRvIII的方法，包括以下步骤： 1. 对EGFR，EGFRvIII基因序列进行分析：采用编写的序列分析程序对突变区之前的基 因序列进行逐个碱基扫描，得到56-70位碱基的低重复性区域； 2. 针对突变区前的低重复区域设计出两条特异性的正向引物，利用序列分析软件进行 特异性反向引物设计，并与突变区之前的正向引物所匹配，分别设计出跨突变区的第一轮 和第二轮特异性扩增引物； 3. 检测模板的获得：采用RT-PCR的方法检测EGFRvIII基因表达情况，更加灵敏、准确 的探知EGFRvIII在表达水平的变化，有利于对其进行特异性的靶向治疗，包括： 1) 组织样品RNA的提取：取适量RNAlater保存的组织样品，参照TRIzol裂解法提取 组织样品RNA; 2) 获得模板cDNA:以组织样品RNA为模板，oligodT为引物进行RNA的反转录得到组 织样品cDNA; 4. EGFRvIII的检测 采用巢式PCR的方法进行连续的两轮PCR，特异性的检测EGFRvIII在组织样品的表达 情况，包括： 1) 以步骤3获得的cDNA为模板（以水为阴性对照，设置空白对照，阳性对照)，进行第一 轮扩增；以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增； 2) 1%琼脂糖凝胶直接检测两轮PCR扩增情况，并根据EGFRvIII目的片段较EGFR野生 型小801bp，直观观察EGFRvIII的组织表达情况； 5. 检测结果的测序验证：切胶回收EGFRvIII目的片段，基因测序验证巢式PCR检测结 果。
[0007] 本发明在RT-PCR和常规PCR的基础上采用巢式PCR的方法来检测组织样品中 EGFRvIII的表达情况，巢式PCR是基于常规PCR，采用第一对引物扩增目的基因片段，第二 对引物特异性扩增第一轮PCR的产物。由于第二对引物位于第一轮PCR产物的内部，而非 特异的目的片段包含两对引物的结合位点的概率极小，因此，第二对引物不会扩增出非特 异的目的片段，确保了第二轮PCR产物的准确性。经过两轮的PCR扩增，组织样品中的低表 达基因经过两次的信号放大，完全可以直接通过琼脂糖凝胶直观的分离开来，进一步提高 了方法的适用性 本发明的有益效果：对于检测肿瘤细胞EGFRvIII具有灵敏度高、准确性高的优点，且 耗时短，结果直观，可以在短时间内灵敏检测出恶性肿瘤组织中EGFRvIII的存在，为靶向 治疗提供良好的如提和基础。
【附图说明】
[0008] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施 例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其它的附图。
[0009] 图1是根据本发明实施例所述的GAPDH扩增各组织样品，用1%凝胶检测结果，其 中，从左至右的样品依次为：D12000标准参照和1-21号样品； 图2为第二轮PCR扩增产物用1%凝胶检测结果，其中，从左至右的样品依次为：D12000 标准参照、1-21号样品、阴性对照样品和阳性对照样品； 图3为第二轮PCR扩增产物的反向测序分析结果，其中，F66-496.seq为第二轮PCR扩 增产物序列，EGFR-vIII.seq为EGFRvIII序列，Consensus,seq为共有序列。
【具体实施方式】
[0010] 下面将结合附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描 述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0011] 根据本发明实施例所述的一种检测肿瘤组织中EGFRvIII的方法，包括以下步骤： 1. EGFRvIII基因序列分析和引物设计 利用编写的序列分析程序对突变区之前的基因序列（GC含量71. 6%，重复率高）进行逐 个碱基扫描，得到56-70位碱基的低重复性区域，利用序列分析软件设计特异性反向引物， 并与突变区之前的正向引物F56(SEQIDN0:1)和F66(SEQIDN0:3)所匹配，利用NCBI 引物搜索软件检测各配对引物在人基因组中的特异性，分别设计得出跨突变区的第一轮和 第二轮特异性反向扩增引物R796(SEQIDN0:2)和R496(SEQIDN0:4); 表1 :PCR检测引物
2. 检测模板的获得 已有报道PCR检测EGFR及其突变体的方法多采用DNA来直接进行扩增，由于包含了诸 多内含子，无论在特异性还是准确性方面都会大打折扣。且基因组水平无法体现EGFRvIII 的表达情况，因此，我们采取了表达水平的EGFRvIII检测，更加直观、准确的检测肿瘤组织 中EGFRvIII的表达情况，为恶性肿瘤的靶向治疗打下基础。
[0012] 1)组织样品RNA的提取，包括如下步骤： 1. 1)组织样品的选取和制备：手术切下的肿瘤组织，切除边缘，选取中间完好的组织块 在最短的时间内放置于RNAlater中在-80°c下保存，防止RNA降解； 1. 2)取30mgRNAlater保存样品，加lmlTRIzol充分研磨，使组织块充分裂解，按 200μ1/mlTRIzol的比例加入氯仿，充分震荡混匀，4°C，12000rpm离心15分钟； 1. 3)取上层水相于另一EP(离心）管中，加入等体积异丙醇沉淀RNA，4°C，12000rpm离 心10分钟，收集沉淀的RNA; 1. 4)用75%乙醇清洗沉淀得到的RNA，4°C，12000rpm离心10分钟； 1. 5)弃掉乙醇，待乙醇挥发殆尽，适量DEPC水溶解组织样品RNA; 2)模板cDNA的获得，包括： 2. 1)准确测得组织样品RNA浓度； 2. 2)高容量cDNA反转录试剂盒说明书严格在冰上配置好反转体系； 表2 :cDNA获得反应体系
轻柔混匀以上反应体系，并利用离心机短暂离心，获得模板cDNA; 表3 :cDNA获得反应程序
2. 3)用Taq高保真DNA聚合酶配置反应体系，引物为F(SEQIDN0:5)和R(SEQID N0:6)，用人内参基因（GAPDH)进行PCR扩增各组织样品，产物1%凝胶检测，以确保RNA的 提取质量及获得的cDNA质量； 表4 :GAPDH扩增体系
3.EGFRvIII的PCR检测 由基因序列分析中我们可以清晰的得到：EGFRvIII较野生型EGFR缺失801bp，可以通 过PCR的方法得到各组织样品的PCR产物，通过凝胶检测，直观地观察EGFRvIII的突变情 况及粗略的表达情况。
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