一种检测肾移植患者在术后感染巨细胞病毒危害程度的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于评估肾移植患者在术后感染巨细胞病毒所带来不同危害程度的检测方法。
【背景技术】
[0002]人类巨细胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)是一种人群中广泛存在的DNA双链病毒，是一种机会性病原体。在移植患者或其他应用免疫抑制剂的免疫缺陷患者，HCMV感染是最常见的感染。具有免疫力的个体初次感染HCMV通常是无症状的，但在移植患者中感染的严重性与免疫抑制的程度却成正比，HCMV感染是肾移植患者最常见的病毒感染并发症。
[0003]移植的实体器官是HCMV感染的主要器官，移植患者HCMV感染所引发的临床症状分两大类:直接效应(单核细胞增多样综合征或组织浸润性疾病)和间接效应，当发生高HCMV血症、免疫组化检测证实病毒感染时，就要高度怀疑HCMV组织浸润性疾病的发生。HCMV感染所致的间接效应是由于长期的病毒低水平复制，经直接的或免疫介导的损伤导致宿主免疫功能紊乱引起的临床征象，包括免疫抑制和移植物排斥，进而影响移植物长期存活。
[0004]目前常用荧光定量PCR法扩增血浆、尿液等体液中HCMV DNA水平来监测HCMV病毒载量。国内以10，000拷贝/mL为阈值，高于此值时，认为患者体内有HCMV病毒高水平复制，处于HCMV感染活动期，需要抗病毒治疗。国外则以30，000拷贝/mL为阈值。HCMV DNA拷贝数反映病毒的复制能力，T细胞功能主要反映机体对病毒的清除能力。从患者体液中HCMV DNA拷贝数、T细胞功能等方面来评估HCMV感染对移植患者的危害，由于缺乏HCMV病毒感染对B淋巴细胞免疫功能危害的评估，故而并不能比较全面地反映免疫功能状态。
[0005]病毒载量检测建立在病毒复制本身，即使是低水平复制、没有症状，病毒复制仍可直接或间接导致一些并发症，而不仅仅是器官损害。因此有利于指导预防性用药。特异的免疫应答检测建立在发生的并发症和器官损害是与HCMV病相关，而不是HCMV复制，虽然说对于确实需要药物治疗的患者更有效，但是待检测到与HCMV病相关的异常免疫应答时，其实已经处于被动的必须及时治疗的状态。肾移植患者HCMV感染后常常同时伴有非特异性和特异的免疫应答，体现者之一即是B淋巴细胞高反应活性状态。
[0006]然而，个体情况不同的肾移植患者在感染同一 HCMV病毒情况下，对各自机体造成的危害并不相同。因此，如何很好地评估HCMV感染状态以及对机体造成的危害程度，从而很好地防治HCMV感染是肾移植术后管理的重要目标。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是:提出一种用于模拟检测不同肾移植患者在感染巨细胞病毒后反映⑶19+B淋巴细胞表型和生物学活性的方法。
[0008]本发明为解决上述技术问题提出的技术方案是:一种检测肾移植患者在术后感染巨细胞病毒危害程度的方法，包括以下步骤:
[0009]a、采血，采集该肾移植患者的肝素钠抗凝外周血20mL ;
[0010]b、⑶19+B淋巴细胞的获取及分析，从淋巴细胞分离液中分离单个核细胞，以磁珠分选所述外周血中⑶19+B淋巴细胞；
[0011]c、制备人巨细胞病毒毒种和定量；
[0012]d、体外培养⑶19+B淋巴细胞并对其分别进行HCMV病毒的直接刺激和间接刺激；
[0013]e、流式检测在HCMV病毒的直接刺激和间接刺激条件下BAFF受体在所述⑶19+B淋巴细胞上的表达，并获得检测结果；
[0014]f、检测在HCMV病毒的直接刺激和间接刺激条件下⑶19+B淋巴细胞的凋亡率，并获得检测结果；
[0015]g、ELI SPOT法检测在HCMV病毒的直接刺激和间接刺激条件下⑶19+B淋巴细胞分泌IgG的能力，并获得检测结果。
[0016]进一步的，所述步骤c中包括以下操作子步骤:
[0017]1、用含10% FBS的F12K完全培养基培养人肺成纤维细胞至长满瓶底；
[0018]i1、弃培养基，PBS洗两遍，加lmL病毒液，置于37°C、5% C02的培养箱中吸附病毒2小时；
[0019]ii1、弃掉病毒液，加含2% FBS的F12K维持培养基继续培养；
[0020]iv、至细胞病变80%以上时收获细胞；
[0021]V、_80°C和常温反复冻融3次，382g离心lOmin取上清，分装并保存至_80°C ；
[0022]v1、Reed-Muench法测定半数组织培养感染量。
[0023]进一步的，所述步骤d中包括以下操作子步骤:
[0024]1、获得HCMV病毒直接刺激组，于六孔板中每孔加lmL 10倍无血清RPMI 1640培养基稀释的HCMV AD-169病毒悬液悬浮的⑶19+B淋巴细胞，其中5 X 105细胞/孔，在37°C、5% 0)2培养箱中、每隔15分钟摇匀一次、吸附2h，之后每孔再加lmL含20% FBS、2%双抗的1640培养基混匀，于37°C、5% C02培养箱中继续培养3天；
[0025]i1、获得HCMV病毒间接刺激组，先将人肺成纤维细胞与⑶19+B淋巴细胞共培养，其中人肺成纤维细胞按2 X 105细胞/孔铺6孔板，待细胞铺满板底，弃上清，每孔加lmLlO倍无血清F12K稀释的HCMV AD-169病毒原液，37°C、5% C02培养箱中吸附病毒2小时，加2mL含胎牛血清的F12K维持培养基，继续培养2天，弃上清，每孔加2mL1640完全培养基悬浮的⑶19+B淋巴细胞5X 105个，继续培养5天。
[0026]本发明的有益效果是:
[0027]本发明中的检测方法在患者尚未感染HCMV病毒之前，进行分析患者B淋巴细胞对HCMV病毒刺激的反应。如果患者B淋巴细胞在HCMV刺激后，细胞膜分子BAFF-R表达持续增高、BAFF信号阻断使B淋巴细胞在HCMV刺激后凋亡率明显增高时，认为患者如果感染HCMV后，B淋巴细胞将发生异常高反应活性。此时，患者发生慢性排斥的几率大大提高，并且影响移植肾长期存活率。患者需要提前进行抗病毒治疗，减少感染HCMV的风险，并考虑改变免疫抑制剂组合。
[0028]因此，本发明对于评估肾移植患者HCMV感染导致的慢性排斥这一间接效应具有重要价值。
【附图说明】
[0029]下面结合附图对本发明的检测肾移植患者在术后感染巨细胞病毒危害程度的方法作进一步说明。
[0030]图1是本发明中检测肾移植患者在术后感染巨细胞病毒危害程度的方法的逻辑示意图。
【具体实施方式】
[0031]实施例一
[0032]本实施例是针对甲肾移植患者在术后进行用于评估感染巨细胞病毒所带来危害程度的检测方法，如图1所示，包括以下步骤:
[0033]步骤a、采血，采集甲肾移植患者的肝素钠抗凝外周血20mL。
[0034]步骤b、⑶19+B淋巴细胞的获取及分析，以淋巴细胞分离液(Ficoll)(购自天津灏洋生物公司)分离单个核细胞，以磁珠分选外周血中⑶19+B淋巴细胞。磁珠分选细胞包括以下子步骤:
[0035](1)取适量单个核细胞悬液，100g离心5分钟，弃上清；
[0036](2)按每107个细胞加80 μ 1 MACS缓冲液，轻轻吹散细胞，混匀；
[0037](3)按每80 μ 1 MACS缓冲液加20 μ 1 CD19磁珠，混匀，4°C孵育15分钟；
[0038](4)按每107个细胞加l-2mL MACS缓冲液混匀，100g，10分钟离心，弃上清；
[0039](5)按每10s个细胞重悬于500 μ 1 MACS缓冲液中；
[0040](6)按照细胞数选择LS柱和MidiMACS分离器，安装好分选装置(所需MACS分离柱和分离器根据细胞数选择)；
[0041 ] (7)用MACS缓冲液润湿分离柱，废液缸收集废液；
[0042](8)将(5)中所得细胞悬液缓慢加入分离柱中，标记的目的细胞滞留在柱子内，未标记的细胞则流出；
[0043](9)用3mL的MACS缓冲液清洗离心管3次；
[0044](10)从分离装置上取下分离柱，置于目的细胞收集管上，加5mL MACS缓冲液，迅速洗脱目的细胞；
[0045](11)离心，弃上清，加培养基重悬备用，使细胞密度约为2 X105个/mL。
[0046]步骤c、人巨细胞病毒(HCMV AD-169)毒种(购自武汉大学病毒研究所)的制备，包括以下子步骤:
[0047](1)用含10% FBS(胎牛血清，下同)的F12K完全培养基培养人肺成纤维细胞(HFL-1)至长满瓶底(90%左右)；
[0048](2)弃培养基，PBS(磷酸盐缓冲液，下同)洗两遍，加lmL病毒液，置于37°C、5%C02的培养箱中吸附病毒2小时；
[0049](3)弃掉病毒液，加含2% FBS的F12K维持培养基继续培养；
[0050](4)至细胞病变80 %以上时(一般4-6d)收获细胞；
[0051](5)-80°C和常温反复冻融3次，382g离心lOmin取上清，分装并保存至_80°C ；
[0052](6)Reed-Muench法测定半数组织培养感染量(Tissue culture infect1n dose，TCID50)。HCMV病毒感染HFL-1细胞致细胞病变，Reed-Muench法应用公式为:距离比例(PD)=(高于50%的死亡百分数-50%)/(高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数)，logTCID50 = log(高于50%的死亡百分数的稀释度)+ (Η)Χ稀释倍数)。
[0053]步骤d、⑶19+B淋巴细胞的HCMV病毒直接和间接刺激体外培养，将分选得到的CD19+B淋巴细胞进行体外培养，分别以HCMV病毒直接或间接刺激。观察不同刺激因素下，⑶19+B淋巴细胞表型及细胞凋亡率的变化、以及分泌IgG水平的变化。
[0054]HCMV病毒直接刺激组:于六孔板中每孔加lmL 10倍无血清RPMI 1640培养基稀释的HCMV AD-169病毒悬液悬浮的CD19+B淋巴细胞(5X 105细胞/孔)，37°C、5%