一种爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1，相关蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因工程技术领域。更具体地，设及一种爪哇根结线虫效应基因 Mj-I-I，相关蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002] 根结线虫是一类世界性分布的重要植物病原物，其寄生范围广，环境适应性强，几 乎可W危害所有农作物。随着现代化农业的发展，根结线虫引起的农业危害损失不断增加。 我国地处溫带和亚热带，气候条件良好，适宜于根结线虫的活动和繁殖，世界性重要根结 线虫病害在我国均有发生，而固着性内寄生的爪哇根结线虫（Meloidogynejavanica)是危 害最严重的根结线虫种类之一。目前根结线虫的防治方法主要有轮作、化学防治和选用抗 病品种，但是在实际生产中，由于轮作的局限性和化学防治给环境造成的巨大污染，W及抗 线虫种质资源的缺乏，寻找高效的、可持续的根结线虫防治方法是目前植物寄生线虫研究 领域的重点，依赖于分子生物学的抗线虫转基因工程也是目前植物线虫研究的热点。
[0003]RNA干扰（RNAinterference,RNAi)是一种转录后的基因沉默现象，最早在秀丽 小杆线虫中发现。RNAi技术通过dsRNA对特异性的祀标mRNA进行识别和降解，影响或抑制 祀标基因的功能，从而对祀标基因所在生物的生长、发育和繁殖产生影响，有时甚至会产生 致死作用。由于根结线虫专性寄生的特点，正向遗传学的研究方法在根结线虫中受到很大 限制，RNAi作为一种反向遗传学技术，在根结线虫的研究中得到广泛的应用。利用RNAi的 方法对根结线虫的特定基因进行沉默，可W抑制根结线虫的侵染、寄生和繁殖，从而减少根 结线虫的危害。运为开发可持续性、高效的根结线虫防治方法提供了科学依据。
[0004] 因此，通过农杆菌介导，应用传统的组织培养方法，可W获得稳定的、纯合的RNAi 转基因抗线虫植株，而祀基因的选择至关重要。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有爪哇根结线虫防治技术的不足，提供一种新 的爪哇根结线虫效应基因Mj-I-I。
[0006] 本发明的另一目的是提供上述效应基因Mj-I-I的相关蛋白MJ-1-1。
[0007] 本发明的再一目的提供上述效应基因Mj-I-I在防治爪哇根结线虫中的应用。
[0008] 本发明上述目的通过W下技术方案实现：
[0009]一种爪哇根结线虫效应基因Mj-I-I，其DNA全长核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示 (即Mj-I-I基因的全基因序列，包括5'端非编码区、3'端非编码区、内含子和外显子）；其 编码区序列如SEQIDNO. 2所示（包括内含子和外显子）；其cDNA序列如SEQIDNO. 3所 示（即编码序列，仅为外显子）。
[0010] 在严格条件下与上述效应基因Mj-I-I杂交且编码与爪哇根结线虫寄生相关蛋白 的DNA分子，或者与上述爪哇根结线虫效应基因Mj-I-I有90%W上同源性且编码根结线虫 寄生相关蛋白的DNA分子，也在本发明的保护范围之内。所述严格条件为：可在0. 1XSSC、 0. 1%SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0011] 上述效应基因Mj-I-I编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 4所示。同 时，经过一个或一个W上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且与爪哇根结线虫寄 生相关的衍生蛋白，也在本发明的范畴之内。
[0012] 进一步地，为了使爪哇根结线虫效应蛋白便于纯化，可W在SEQIDNO. 4 所示氨基酸序列的氨基末端或簇基末端连接上特定标签，所述特定标签为5~6个精氨酸， 或2~12个组氨酸，或如SEQIDNO. 33所示序列，或如SEQIDNO. 34所示序列，或如SEQ IDNO. 35所示序列。如表1所示，但不限于表1。
[001引表1标签序列
[0014]
[0015] 上述蛋白可W人工合成，也可W先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0016] 一种重组表达载体，由基因Mj-I-I的片段插入到植物表达载体的多克隆位点构 建而成，所述基因Mj-I-I的序列如SEQIDNO. 1所示。
[0017] 具体地，可W是一种重组RNAi植物表达载体（如重组表达载体1300-RNAi-Mj1)， 所述重组RNAi植物表达载体是由出发载体pMin(出发载体pMin由本发明人构建）的多 克隆位点插入上述爪哇根结线虫效应基因Mj-1-l，即该基因的部分外显子片段如SEQID NO. 31所示序列构建而成。该SEQIDNO. 31所示序列为SEQIDNO. 3的5'端的第62~ 380bp所不的DNA分子。
[001引所述出发载体pMin是一种植物RNAi载体的中间载体，将含有爪哇根结线虫效应 基因Mj-I-I的该RNAi中间载体的RNAi表达盒进一步克隆到植物表达载体中，最终的RNAi 植物表达载体转化农杆菌后，通过植物组织培养的方法转化到植物体内，可W在植物中产 生所述基因的dsRNA，当根结线虫侵染该植株后，dsRNA进入根结线虫的体内，使所述基因 的mRNA降解，引发所述基因的失活，严重的减弱了线虫的寄生能力，从而抑制线虫的侵染、 寄生、繁殖和传播。
[0019] 一种重组菌，包含上述爪哇根结线虫效应基因Mj-I-I或者上述重组载体。
[0020] 另外，含有上述爪哇根结线虫效应基因Mj-I-I的重组基因表达盒、转基因细胞系 等，均在本发明的保护范围之内。
[0021] 上述爪哇根结线虫效应基因Mj-I-I及其蛋白在防治根结线虫（尤其是爪 哇根结线虫）方面的应用也在本发明的保护范围之内。
[0022] 进一步地，上述爪哇根结线虫效应基因及其蛋白可应用于提高植 物抗根结线虫（尤其是爪哇根结线虫）的能力。优选地，所述竹植物为双子叶植物或单子 叶植物，尤其是烟草，如本生烟。
[0023] 更进一步地，上述爪哇根结线虫效应基因Mj-I-I在可应用于构建抗根结线虫植 物，进一步地，是应用于构建抗爪哇根结线虫的转基因植物。
[0024] 优选地，所述转基因植物的目的植物优选为双子叶植物或单子叶植物，尤其是烟 草，如本生烟。
[00巧]作为上述应用的一个方面，可W将含有爪哇根结线虫效应基因Mj-I-I的重组表 达载体利用农杆菌导入至目的植物中，或者通过使用Ti质粒、化质粒、植物病毒载体、直接 DNA转化、显微注射、电导入或基因枪等生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物 组织培育成植株，得到抗根结线虫的转基因植物。
[0026] 作物一种优选的可实施方案，上述构建抗根结线虫转基因植物的步骤如下：
[0027]SI.构建重组表达载体1300-RNAi-Mjl
[0028]SI1.W爪哇根结线虫二龄幼虫cDNA为模板，分别W引物对MjISac和MjIPst，W 及MjIS地和Mj化pn，进行PCR扩增，
[0029]S12.将得到的PCR产物分别使用限制性内切酶SacI和PstI、SphI和化nI进 行酶切，纯化回收后，均连接至经限制性内切酶SacI和PstI、W及SphI和化nI酶切的 载体pMin，获得重组表达载体pMin-Mj-1-l;
[0030]S13.使用限制性内切酶BamHI和化ndIII对重组表达载体pMin-Mj-1-l进行 双酶切，纯化回收后连接至经限制性内切酶BamHI和化ndIII双酶切的植物表达载体 pCambial300,获得重组表达载体1300-RNAi-Mjl;重组表达载体1300-RNAi-Mjl中酶切位 点BamHI和化ndIII之间插入了基因Mj-I-I的双链DNA片段；
[0031]S2.将重组表达载体1300-RNAi-Mjl转化根癌农杆菌EHA105,得到重组农杆菌A;
[0032]S3.重组农杆菌A经叶盘法转化烟草，进行组织培养，用引物Hy评和Hy曲，W及 IntronF和IntronR检测为阳性的即为Mj-I-IRNAi转基因烟草；
[0033] 其中，步骤Sll所述引物MjlSac的序列如SEQIDNO. 23所示，引物MjlPst的序 列如SEQIDNO. 24所示，引物MjIS地的序列如SEQIDNO. 25所示，引物Mj化pn的序列如 沈QIDNO. 26所示；
[0034] 步骤S12所述载体pMin的构建方法为：
[0035] (1)载体中各个元件的获得
[0036]W载体pCambial300的质粒为模板，W引物35SF和35SR扩增得到双35S启动子的 序列，序列如SEQIDNO. 38所示；其中，所述引物35SF的序列如SEQIDNO. 32所示，加有 酶切位点BamHI;引物35SR的序列如SEQIDNO. 33所示，加有酶切位点HindIII、SphI、 Pst1、化〇I和SacI;
[0037]W载体pMD18T-IGS的质粒为模板，W引物IntronF和IntronR扩增得到Intron 的序列，序列如SEQIDNO. 39所示；其中，所述引物IntronF的序列如SEQIDNO. 34所示， 加有酶切位点PstI;引物IntronR的序列如SEQIDNO. 35所示，加有酶切位点SphI、Sal I和KpnI;
[0038]W载体pCambial300的质粒为模板，W引物NosF和NosR扩增得到Nos终止子的 序列，序列如SEQIDNO. 40所示；其中，所述引物NosF的序列如SEQIDNO. 36所示，加有 酶切位点SphI;引物NosR的序列如SEQIDNO. 37所示，加有酶切位点化ndIII;
[0039] (2)pMin载体的构建
[0040] 1)WTA克隆的方式把带有合适酶切位点的双35S启动子的序列（如SEQID N