一种牛病毒性腹泻病毒毒株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及一种牛病毒性腹泻病毒毒株及其应用。
【背景技术】
[0002] 牛病毒性腹泻病毒度OVineViralDiarrheaVirus,BVDV)，又称为牛病毒性腹 泻-黏膜病毒，是一种危害严重的疾病，其感染牛可呈现多种临床症状。自1946年Olafson 等首次在美国纽约州发现该病W来，已在世界范围内广泛流行，给世界各国畜牧业造成了 严重的经济损失。流行病调查结果表明北京地区BVDV呈现广泛感染的态势，持续性感染牛 是造成广泛感染的主要原因，同时，流行毒株的基因差异性较大，为该病的防控带来很大困 难。
[0003]目前，控制和根除BVDV的整体解决方案计划主要包括疫苗接种、加强监测、淘汰 持续感染和免疫耐受的动物等综合措施控制本病，才能取得良好效果。目前，我国仅有BVDV 抗体检测技术，如深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中屯、发明的牛病毒性腹泻病 毒抗体快速检测试纸条及其制备方法（【申请号】201310136066),陈眷锋等发明的牛病毒性 腹泻病毒抗体间接化ISA检测方法。但BVDV抗体检测只能用于初步筛查，无法准确查出持 续感染牛，而目前牛群中BVDV抗体阳性普遍存在，所W仅检测BVDV抗体并无临床意义。
[0004] 随着我国牛业和奶牛业养殖量的不断增加，饲养方式向规模化和集约化等现代养 殖模式的转变，BVDV感染率不断升高，我国养牛业受该病的威胁也越来越大，很有必要加强 对BVDV的诊断与防控工作。但由于我国对BVDV的研究起步较晚，对BVDV认识及危害的重 视程度不足，也没有系统开展全国范围的BVDV分子流行病学调查，对BVDV流行规律和主要 流行基因型或基因亚型缺乏相关研究数据；同时，BVDV属于RNA病毒，极易发生基因变异， 用传统的标准毒株制备疫苗和检测试剂盒难W应对现有的所有临床毒株；另一方面，目前 国外进口的BVDV检测试剂盒价格昂贵，而国内尚无自主研发的商品化BVDV抗原检测试剂 盒，难W实现对规模化牛场的大规模牛群病原筛查和种群净化。
[0005] 因此，需要进一步研制出一种能够运用于实际生产中的BVDV抗原检测方法，而其 中关键的一步是制备抗BVDV抗体方法的探索，而抗体的制备需要找到适合生产的牛病毒 性腹泻病毒毒株。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于填补目前我国尚无自主研发的抗BVDV临床毒株抗体制备技术 的空白，为进一步建立适用于实际生产中大规模筛查BVDV抗原检测方法奠定基础。
[0007] 为实现W上目的，本发明提供了一种牛病毒性腹泻病毒BJ1305毒株，分类命名为 牛病毒性腹泻病毒度ovineViralDiarrheaVirus,BVDV)，其保藏号为CGMCCNO. 11185。
[0008] 本发明的发明人于2010-2013年间调查了北京周边的25个牛场，采集和检测了临 床样品4, 000余份，用间接化ISA方法对随机选取的1，000份样本进行了抗体检测，用进口 商品化抗原捕获化ISA和RT-PCR方法对病毒抗原进行了检测，结果检测出18份抗原阳性 样品。
[0009] 用细胞培养法对阳性样本进行病毒分离，用免疫巧光技术对阳性样品进行鉴定， W确定分离到的临床毒株为BVDV。同时对分离到的毒株5' -UTR和化ro进行了PCR扩增 和克隆测序，通过测序结果及文献报道序列比对，对分离到的病毒进行基因亚型的鉴定。最 终，我们选取其中从流产奶牛血清中分离到的BVDV临床毒株BJ1305株为本发明的病毒抗 原，该毒株属于非细胞病变型，基因亚型鉴定为BVDV-Id型于2015年9月7日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、。其核巧酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[0010] 本发明还提供了含有所述BJ1305毒株的细胞培养物。
[0011] 可选的，所述细胞培养物为含有BJ1305毒株的MD服单层细胞培养物。
[0012] 本发明还提供了利用所述的BJ1305毒株制备的抗牛病毒性腹泻病毒抗体，所述 抗体可W为单克隆抗体或多克隆抗体。
[0013] 可选的，所述抗体为多克隆抗体。
[0014] 本发明的抗牛病毒性腹泻病毒多克隆抗体，可用于化ISA、Dot-ELISA、胶体金试纸 条等诊断试剂盒的研制。
[0015] 本发明还提供了所述的抗体的制备方法，所述制备的步骤包括：将BJ1305病毒液 接种于MDBK单层细胞，培养后收集培养物制成种毒；再将所述种毒接种于MDBK单层细胞进 行病毒繁殖。
[0016] 本发明还提供了所述的BJ1305毒株在制备预防牛病毒性腹泻病毒所致疾病的药 物中的应用。
[0017] 本发明还提供了所述的BJ1305毒株在制备预防牛病毒性腹泻病毒所致疾病的检 测试剂中的应用。
[0018] 本发明还提供了含有所述抗牛病毒性腹泻病毒抗体的药物。
[0019] 本发明还提供了含有所述抗牛病毒性腹泻病毒抗体的检测试剂。
[0020] 本发明所提供的毒株具有地区新发并且流行的特点，免疫源性强，由于其分离自 北京地区，所W利用该毒株所开发的产品能够更加特异性的针对北京地区流行的牛病毒性 腹泻病毒所引起的疾病。本发明所提供的抗体具有敏感性强，特异性强的特点；本发明所提 供的抗体制备方法具有造作简便、生产周期短、成本低、易于保存的优点。
[0021] 保藏信息：牛病毒性腹泻病毒株BJ1305,分类命名为牛病毒性腹泻病毒，保藏单 位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所（邮政编码：100101)，保藏日期：2015年9月7 日，保藏编号：CGMCCNO. 11185。
【附图说明】
[002引 图1抗体纯化前后SDS-PAGE凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0023] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。需要理解的是W下实施例的给 出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在 不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可W对本发明进行各种修改和替换。
[0024]实施例I病毒分离及鉴定。
[00巧]1.临床样品采集及BVDV检测
[0026] 本发明的发明人于2010-2013年间调查了北京周边的25个牛场，采集和检测了临 床样品4, 000余份，用间接化ISA方法对随机选取的1，000份样本进行了抗体检测，用进口 商品化抗原捕获化ISA和RT-PCR方法对病毒抗原进行了检测，结果检测出18份抗原阳性 样品。检测方法如下：
[0027] 反转录反应体系：应用两步法进行反转录。
[0028]第一步；
[0029] Randomprimer(250ng/JiL)IyL
[0030]vRNA(<500ng) 12yL
[0031] 混匀，瞬时离屯、后65°C5min，冰上Imin。
[0032]第二步：
[0033] 5 " First-StrandBuffer 4jiL 0.1 MDTTI.LiL RNasin(40U/liL) I'liL
[0034] S叩erSci.iptinRT(200 IuL 总体积 20曲
[0035] 依次加入表中各成分，轻柔吹吸混匀，反应条件：25°C5min，50°C60min，70°C15mi n。将反转录后的cDNA产物-20°C保存备用。
[0036] 利用反转录获得的cDNA为模板，分别扩增BVDV高度保守5' -UTR和NP"片段，弓I 物如表1所示。
[0037] 表1引物序列
[00測 PCR反应体系：
[0040] ddH?0 14.5 ^iL 上游引物（lOfxM) I片L 下游引物（lOfxM) 1 uL dN'TTs (各2.5mM) 2 uL Taq buffer 2.5 j.iL cDNA 3 p.L Ex Taq I yL 总体积 25 uL
[0041] 依次加入W上各成分，瞬时离屯、混匀。
[004引 PCR反应条件：
[0043] 95V 5 min 94°C 30 S 56-58°C 45 S - 40个循环 72°C I min ITC IOniin
[0044] 25 °C
[0045] 反应后对扩增的BVDV5'-UTR与化ro产物I.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，W确定病 毒是否为BVDV。
[0046] 阳性样本病毒分离及鉴定：
[0047] 用细胞培养法对阳性样本进行病毒分离，用免疫巧光技术对阳性样品进行鉴定， W确定分离到的临床毒株为BVDV。同时对分离到的毒株5' -UTR和化ro进行了PCR扩增 和克隆测序，通过测序结果及文献报道序列比对，对分离到的病毒进行基因亚型的鉴定。最 终，获得从流产奶牛血清中分离到的BVDV临床毒株BJ1305株为本发明的病毒抗原，该毒株 属于非细胞病变型，基因亚型鉴定为BVDV-Id型，其核巧酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[004引实施例2免疫抗原的制备
[0049] 1、种毒制备
[0050] 取实验室保存的牛肾细胞系MBDK细胞进行培养，将BVDV病毒BJ1305株使用DMEM F12培养基稀释后接种单层细胞，每细胞瓶接种Iml，加入细胞培养液，置于37°C，5 %C〇2细 胞培养箱中培养24h，收集细胞培养物冻融进行超声破碎获得繁殖种毒，破碎功率为200W， lOmin，将繁殖种毒于液氮中保存。
[0051] 2、病毒繁殖制备
[0052] 将MBDK细胞进行单层培养，将繁殖种毒100倍稀释接种细胞单层，加入含2 %无 BVDV的胎牛血清的细胞完全培养液，置于37°C，5%C〇2细胞培养箱中培养2地，反复冻融数 次，将各瓶细胞混合。3、病毒抗原浓缩及纯化
[0053] (1)高速离屯、
[0054] 高速离屯、去除细胞碎片，将感染细胞液于7000g，4°C离屯、45min，收集上清液，将 沉淀用适量灭菌PBS悬浮后，冻融2次，超声波处理后，7000g，4°C离屯、30min，收集上清，弃 沉淀。
[00巧](2)超速离屯、
[0056] 超速离屯、浓缩病毒取上步获得的上清液在100,OOOg, 4°C离屯、化，弃上清，用原体 积1/100的灭菌PBS悬浮沉淀，超声波粉碎沉淀颗粒，使病毒粒子分散，悬浮液均匀获得病 毒粗提液。
[0057] 做病毒初步纯化
[005引配制20%和50%的薦糖溶液，沿管壁缓慢加入病毒粗提液。80000-100000g，4°C离屯、化，收集液体界面中的条带，于无菌PBS中重悬并重复W上步骤（I)和（2)，得到浓缩 和纯化的抗原，作为免疫用病毒抗原。
[0059] (4)BCA法测病毒蛋白浓度
[0060] 用商品化BCA试剂盒检测抗原蛋白浓度，在562nm下测吸光值与蛋白质浓度成正 比，据此可测定蛋白质浓度为1. 03mg/ml，并W此浓度作为免疫抗原浓度。
[0061] 4、动物免疫及血清收集
[0062] (l)BALB/c小鼠免疫
[0063] 选取6周龄BALB/c小鼠10只，按表2程序进行免疫接种，间隔两周（其中病毒含 量按蛋白浓度计），另外预留5只BALB/c小鼠作为空白对照。