一种cd3ak细胞培养组合物及其培养方法
【技术领域】
[0001]本发明设及细胞培养技术领域，特别设及一种CD3AK细胞培养组合物及其培养方 法。
【背景技术】
[0002] CD3AK细胞（anti-CD3antibodyinducedactivatedkillercells)是指淋己 细胞等单个核细胞经抗CD3单克隆抗体（CD3McAb)激活后的杀伤细胞，在激活后，无需 CD3McAb持续存在，小剂量外源性的IL-2就可W维持其活性增殖，是WCD3+CD8叮为主的异 质性细胞群，其前体细胞来源丰富，主要是T细胞，W其存活时间长，较低的IL-2依赖性。
[0003]CD3AK细胞具有广谱杀瘤活性，其杀伤肿瘤细胞是W其伪足和突起与祀细胞紧密 结合，祀细胞的死亡形式是调亡和溶解坏死，其抗瘤作用优于LAK细胞，成为继LAK和TIL 之后，肿瘤AIT研究中最受关注的肿瘤效应细胞。CD3AK细胞具有比LAK细胞和TIL更强 的扩增及抗肿瘤能力，体外抗肿瘤能力比常规LAK高6~20倍，对NK细胞敏感和LAK细胞 敏感的肿瘤细胞均有不同程度的杀伤效应。能够有选择地直接或间接杀伤肿瘤细胞，但对 自体或异体转化的淋己细胞和正常组织细胞没有杀伤活性，对人体没有毒副作用。CD3AK 细胞能够第一时间纠正患者的免疫功能，提高肿瘤患者对手术、放疗和化疗的耐受，并且可 W消灭残存肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的生长、分化、浸润，预防癌症复发有重要的意义，所W CD3AK细胞在肿瘤治疗方面有着重要的应用前景和价值。
[0004]目前，对于CD3AK细胞的培养技术主要是采用厮血分离淋己细胞，经CD3McAb和 IL-2诱导CD3AK细胞，加入胎牛血清。但该方法存在一定的缺陷，如虽然细胞扩增数量较 大，但是细胞的杀伤活性较低。因此，急需提供一种既能大量扩增CD3AK细胞的数量，又能 提高细胞的杀伤活性的CD3AK细胞培养方法。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种CD3AK细胞培养组合物及其培养方法。该CD3AK细 胞培养组合物可促进CD3AK细胞的增殖，提高对肿瘤细胞的杀伤活力。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种CD3AK细胞培养组合物，包括CDMcAb、IL-2、IL-15、田屯皂巧、 汉黄琴素、血清和基础培养基。
[0008] 本发明将CDMcAb、比-2、IL-15、田屯皂巧、汉黄琴素、血清添加入基础培养基，培养 CD3AK细胞，可促进CD3AK细胞的增殖，提高对肿瘤细胞的杀伤活力，且CD3AK细胞的纯度较 局。
[0009] 作为优选，组合物中各组分用量为：
[0010] CDMcAb IO~-50 H gZmL lL-2 100~300U/mL 山-15 10、'30U/mL 田七皂普 10~50mg/mL 汉黄萃素 0.2~6mg/L 血清 2%-^0%体积分数 基础培养基 余量。
[0011] 在本发明提供的一些实施例中，本发明培养组合物中各组分用量为：
[0012] CDMcAb 10 UgZmL IL-2 lOOU/iriL 比巧 lOU/mL 田七皂每 lOmg/mL 汉黄茶素 0.2mg/L 血清 2〇/。体积分数 基础培养基 余量。
[0013] 在本发明提供的另一些实施例中，本发明培养组合物中各组分用量为：
[0014] CDMcAb 50 U g/mL 1L-2 300U/niL
[0015] 圧-15 30U/niL 田毛皂鲁 50nig/niL 汉黄茶素 6mg/L 血證 20%体积分数 基础培养基 余量。
[0016] 在本发明提供的另一些实施例中，本发明培养组合物中各组分用量为：
[0017] CDMcAb 30 U g/mL IL2 200U/mL 化.-15 20U/inL 巧七皂皆 SOrngZmL 汉黄零素 3mg/L 血清 10%体积分数 基础培养基 余量。
[0018] 作为优选，基础培养基为RPMI-1640基础培养基。
[0019] 作为优选，血清为自体血清。
[0020] 本发明还提供了一种CD3AK细胞培养方法，包括如下步骤：
[0021] 采用基础培养基将PBMC重悬，加入CDMcAb、比-2、比-15、田屯皂巧、汉黄琴素和血 清，进行细胞培养，每隔3天补液一次，获得CD3AK细胞。
[0022] 作为优选，本发明CD3AK细胞培养方法中各组分用量为：
[0023] CDMcAb KK50 |i g/rriL 比-2 100--300U/mL IL-15 10~30U/mL 田七皂普 KK50mg/mL 汉黄茶素 0.2~6mg/L 血清 2%~20%体积分数 基础培养基 余量。
[0024] 在本发明提供的一些实施例中，本发明组合物中各组分用量为：
[00巧] CDMcAb lOlig/rnL 1L-2 lOOU/mL 山-15 lOU/mL
[0026] 巧毛皂普 1 Omg/mL 汉黄茶素 0.2mg/L 血清 2〇/〇体积分数 基础培养基 余量。
[0027] 在本发明提供的另一些实施例中，本发明组合物中各组分用量为：
[0028] CDMcAb 50 U g/inL IL-2 300U/mL ILl 5 30UAiiL 田"t:皂普 SOmgZmL 汉黄茶素 6mg/L 血清 20%体积分数 基础培养基 余量。
[0029] 在本发明提供的另一些实施例中，本发明组合物中各组分用量为：
[0030] CDMcAb 30 U g/mL IL2 200U/mL IL-15 20U/mL 田七皂普 30mg/mL 汉黄茶素 3mg/L 血簿 ！0%体转分獄， 基础培养基 余量。
[0031] 作为优选，基础培养基为RPMI-1640基础培养基。
[0032] 作为优选，血清为自体血清。
[0033] 在本发明提供的一些实施例中，细胞培养的条件为37°C、浓度为5%的0)2。
[0034] 作为优选，PBMC的接种密度为（1~10)XIO6个/mL。
[003引在本发明提供的一些实施例中，PBMC的接种密度为1XIO6个/mL。
[0036] 在本发明提供的一些实施例中，补液为：补加基础培养基、CDMcAb、比-2、IL-15、田 屯皂巧、汉黄琴素，CDMcAb终浓度为10~50yg/mL，IL-2终浓度为100~300U/mL，比-15 终浓度为10~30U/血，田屯皂巧终浓度为10~50mg/mU汉黄琴素终浓度为0. 2~6.Omg/ L补液后细胞密度在（0. 5~1. 0)XIO6个/mL。
[0037] 作为优选，细胞培养的天数为7~10天。
[0038] 本发明提供了一种CD3AK细胞培养组合物及其培养方法。该CD3AK细胞培养组合 物包括CDMcAb、IL-2、IL-15、田屯皂巧、汉黄琴素、血清和基础培养基。本发明至少具有如 下优势之一：
[0039] 1、本发明CD3AK细胞培养组合物可促进CD3AK细胞的大量增殖，并且提高其细胞 的杀伤活性；
[0040] 2、本发明采用自体血清来促进细胞的增殖，避免了外源性蛋白及病毒的污染；
[0041] 3、本发明只需较低剂量的IL-2,大大降低了生产成本；
[0042] 4、本发明培养方法培养出来的CD3AK细胞纯度较高。
【附图说明】
[0043] 图1是本发明培养方法和传统培养方法培养的CD3AK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性 检测结果。
【具体实施方式】
[0044] 本发明公开了一种CD3AK细胞培养组合物及其培养方法，本领域技术人员可W借 鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域 技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过 较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述 的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[004引术语解释：
[0046]CDMcAb:CD3AK细胞（anti-CD3antibodyinducedactivatedkillercells)是指 淋己细胞等单个核细胞经抗CD3单克隆抗体（CD3McAb)激活后的杀伤细胞，在激活后，无需 CD3McAb持续存在，小剂量外源性的IL-2就可W维持其活性增殖，是WCD3+CD8+T为主的异 质性细胞群，其前体细胞来源丰富，主要是T细胞，W其存活时间长，较低的IL-2依赖性。
[0047] 比-2 :即白细胞介素-2(interle址in-2,比-2)，又名T细胞生长因子灯cell growthfactor,TCRF)。主要由活化的CD4+Thl细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子。 可促进ThO和CTL的增殖，故为调控免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监 视。环抱素、他克莫司等免疫抑制剂可W抑制其活性和生成。
[0048] 比-15:即白细胞介素-15(interle址in-15,比-15)，由多种细胞产生，生物学作 用与IL-2相似。其细胞来源和祀细胞分布较IL-2广，故可能在不表达IL-2的部位发挥类 似IL-2的效应。
[0049] 田屯皂巧：是从S屯提取的S屯皂巧，包括人参皂巧化1、人参皂巧RgUS屯皂巧 Rl等，能增加脑血管流量，扩张脑血管，改善血流动力学，降低脑缺血。
[0050] 汉黄琴素：又名5, 7-二径基-8-甲氧基-2-苯基-4H-1-苯并巧喃-4-酬，是一 种溶于有机溶剂而不溶于水的黄色针状结晶物。用小鼠切除的小肠实验表明有磐粟碱样的 解疫作用，但作用较弱，约为磐粟碱的五分之一。大鼠口服可降低乙醇所致的甘油=酸醋水 平。还具有抗癌作用、利尿作用。
[0051]外周血单个核细胞（Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC):即外周血中具 有单个核的细胞，包括淋己细胞和单核细胞。
[0052]本发明提供的CD3AK细胞培养组合物及其培养方法中所用CDMcAb、细胞因子、培 养基、中药成分均可由市场购得。
[0053] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0054] 实施例1CD3AK细胞的培养 [00巧]1、外周血单个核细胞的分离
[005引采集50~1