一种细胞培养液及其在培养巨核祖细胞中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞培养领域，尤其设及一种细胞培养液及其在培养巨核祖细胞中的 应用。
【背景技术】
[0002] 巨核细胞祖细胞（megakaryo巧teprogenitorcell)是一种使人们产生巨核细胞 的细胞，它是从骨髓祖（CRJ-GEMM)而得，简称巨核祖细胞。巨核祖细胞存在于IL-6R-细 胞群中，而CD34+细胞可分为两个细胞亚群，表达比-6R和不表达比-6R，比-6R+细胞能 被刺激形成粒-巨隧细胞、淋己细胞和粒细胞，而IL-6R-细胞当被给予IL-6/SIL-6R时可 形成红系及巨核系细胞。造血干细胞首先分化生成巨核系祖细胞，也称巨核系集落形成单 位（colonyformingunit-megakaryo巧te,C即-Meg)。巨核系祖细胞分化成为成熟的巨核 细胞后，其边缘部分破裂脱落，形成血小板，每个巨核细胞能生成1000-6000个左右的血小 板；巨核细胞虽然在骨髓的造血细胞中为数最少，仅占骨髓有核细胞总数的0. 05%，但其 产生的血小板却对机体的止血功能极为重要。
[0003] 如今恶性肿瘤严重危害人类健康的主要疾病之一，目前主要是通过手术治疗并结 合放化疗。当患者在接受高剂量放化疗后，骨髓造血功能低下，常会出现血小板减少，严重 时会造成患者出血死亡。临床上常采用输注血小板，但血小板来源有限，存活期短，体外易 失活，且反复输注血小板易导致输注无效并增加输血传播疾病的危险。
[0004] 1997年，Bertolini等从外周血中分离CD34+，体外诱导扩增巨核细胞7天，用于 患者血小板恢复。结果显示，体外诱导的巨核细胞可替代血小板输入，或减少血小板输入次 数。2000年，Paquette等将体外动员的外周血细胞经体外诱导扩增巨核细胞9天后，用于改 善大剂量化疗的乳腺癌病人中性粒细胞减少、血小板减少和贫血症状。VandenOudenrijn 等对外周血、骨髓、厮血来源的CD34+细胞体外扩增进行比较，发现厮血来源的CD34+具有 更强的巨核细胞扩增能力。由于厮血造血干细胞移植后血小板的恢复较外周血、骨髓慢，因 此采用体外诱导、扩增巨核祖细胞和巨核细胞，然后输注患者体内，进一步发育成血小板， 缩短血小板的恢复期。将巨核祖细胞用于恶性肿瘤的治疗是目前的研究热点，
[0005] 但是，目前的体外培养巨核祖细胞的方法增殖速度较慢，且所得细胞中所包含的 巨核祖细胞的数量并不多，因此，研究开发产量高，纯度大的巨核祖细胞的方法十分必要。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞培养液及其在培养巨核祖 细胞中的应用。本发明提供的细胞培养液能够用于巨核祖细胞的培养，且将其用于巨核祖 细胞的培养所得细胞数量大，其中巨核祖细胞的含量较高。
[0007] 本发明提供的细胞培养液包括基础培养基、WNT3a蛋白、膜岛素、Flt-3L白蛋白、 非必需氨基酸、血小板生成素、干细胞生长因子，白介素3和白介素6。
[0008] 在本发明的实施例中，WNT3a蛋白、膜岛素、Flt-3L白蛋白、非必需氨基酸、血 小板生成素、干细胞生长因子，白介素3和白介素6的质量比为（12~35):(12XIO3~ 35X103):(20 ~45):(30X103~ 100X103):(30X103~80X103):(15 ~50):(10~40): (10 ~40) :(10 ~50)。
[0009]Wnt信号在中枢神经系统发育过程中起重要的作用，控制着细胞的生长和发育， WNT3a蛋白是Wnt家族的成员之一，实验表明其对神经干细胞的增殖及分化哟一定的调控 作用。
[0010] 膜岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。细胞培 养基中添加膜岛素能够促进细胞增殖，保持细胞活性。
[0011]FMS样酪氨酸激酶 3 配体（fetallivertyrosinekinaserec巧torligand, Flt-3L)是W中强大的造血细胞生长因子，在干细胞和免疫系统的正常发育过程中起着重 要的作用。
[001引白蛋白（又称清蛋白，a化umin，A化）是血浆中含量最多、分子最小、溶解度大、功 能较多的一种蛋白质，具有保护血细胞保护和调节凝血的功能，有利于防止细胞成团。
[0013]非必需氨基酸（non-essentialaminoacid,NEAA)，包含7种细胞培养所需非必 需氨基酸，即天冬氨酸、天冬酷胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、径脯氨酸。非必需氨基 酸的添加能够增加细胞的繁殖力，延长细胞的生存时间。
[0014] 血小板生成素灯虹omboietinTP0)又名巨核细胞生长因子，能够调节造血祖细胞 演化成成熟巨核细胞增殖和分化；
[0015] 干细胞生长因子（SC巧是由骨髓微环境中的基质细胞产生的一种酸性糖蛋白，它 是一种重要的造血细胞因子，主要作用于早期的造血干细胞和原始造血祖细胞，促进其增 殖和分化，在维持造血细胞存活，促进造血细胞增殖和分化，调控各系造血细胞的生长发育 中起着重要作用。
[0016] 白细胞介素-3,是白细胞介素家族重要成员之一，简称白介素3 (IL-3)，又名多向 性集落刺激因子（multi-CSF)，是一种细胞因子，属于白细胞介素的一种。它是由T淋己细 胞所产生，能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。
[0017] 白细胞介素-6,简称白介素6(IL-6)，属于白细胞介素的一种。它是由纤维母细 胞、单核/巨隧细胞、T淋己细胞、B淋己细胞、上皮细胞、角质细胞、W及多种瘤细胞所产生。 白介素6能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。
[0018]本发明将上述组分复配，能够给细胞提供更加丰富的营养。实验表明，本发明提 供的培养液用于巨核祖细胞的培养，能够选择性的促进巨核祖细胞的生长和增殖。W本发 明提供的培养基培养巨核祖细胞20天，细胞数量增殖400倍~450倍，所得细胞中CD34+、 CD41+双阳性表达率不低于35%。该效果显著优于现有技术的培养基（p<0. 01)。
[0019] 在本发明的实施例中，膜岛素为人膜岛素。
[0020] 在一些实施例中，人膜岛素为重组人膜岛素。
[0021] 在本发明的实施例中，白蛋白为牛血清白蛋白。
[0022] 本发明提供的培养液中不含有牛血清，降低了异源血清所带来的风险。
[0023] 在本发明的实施例中，培养液中各组分的浓度分别为：
[0024]
[00 巧]
[0026] 在一些实施例中，培养液中各组分的浓度分别为：
[0027]
[002引在一些实施例中，培养液中各组分的浓度分别为： [0029] WNT3a蛋.白' 20ng/ml 肤岛素 200?ml 巧t-3L 35ng/ml 食蕾# 60mg/ml 非必需氨基酸 60mg/ml 血小板生成素 40ng/ml 干细胞生长因子 2 5ng/ml 白介素3 25ng/ml 白介素6 30ng/ml
[0030] 在一些实施例中，培养液中各组分的浓度分别为：
[0031] WNT3a蛋白 35ng/nil 腺岛素 35mg/inl Flt-3L 45ng/ml
[0032] 白蛋白 lOOrng/ml 非必需氨基酸 8 0mg/ml 血小板生成素 50iig/ml 干细胞生长巧子 40ng/ml 白介素3 40ng/ml 自奔薰6 SOng/ml
[0033] 在本发明的实施例中，基础培养基为IMEM培养基。
[0034] 利用本发明提供的培养基培养白膜层细胞，20天后细胞数量增殖400~450倍，其 中CD34+XD41+双阳性表达率不低于35%。该实验结果表明，本发明提供的培养基能够选 择性的促进巨核祖细胞的生长，从而提高所得细胞中巨核祖细胞的含量。
[0035] 本发明提供的细胞培养液在巨核祖细胞培养中的应用。
[0036] 本发明还提供了巨核祖细胞的培养方法，包括W下步骤：
[0037]