促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及皮肤创伤修复的技术领域，尤其涉及一种促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞的多因子载体exosome的制备，本发明还涉及这种多因子载体制成的溶剂或针剂，以及这种多因子载体和溶剂或针剂的应用。
【背景技术】
[0002]皮肤软组织损伤是日常生活中常见的一种创伤；目前常用的皮肤软组织损伤治疗主要是通过全身支持治疗，创面的清理以及新型敷料和皮肤移植等方法，传统的治疗方法虽然有一定的效果但愈合时间快慢难于把握，瘢痕大小，皮源紧张和易感染的问题有待解决。
[0003]近年来，以干细胞特别是以间充质干细胞(MSC)(脂肪干细胞是间充质干细胞中的一种，相比其他间充质干细胞脂肪干细胞拥有取材方便，无伦理学限制等优势)为基础的皮肤再生医学研究得到广泛关注，研究表明MSC对组织损伤有良好的修复作用，尽管其机制尚未完全阐明，但初步结果显示可能与损伤的刺激及局部创面微环境中各种细胞因子有关，它们通过促进MSC趋化以及诱导MSC向所需要的组织或细胞分化来参与损伤组织的修复，因此在组织的修复中具有临床应用前景。然而，MSC植入体内后存在长期应用安全性问题以及储存和运输困难等问题极大的限制其临床应用。
[0004]随着研究的深入发现MSC发挥组织损伤修复的一个重要机制是旁分泌效应，在促进创面愈合过程中比细胞转分化起的作用更大。其旁分泌中最有效的活性成分是MSC分泌的exosome，在细胞信息传递中起着非常重要的作用，这一机制的提出为基于各种来源MSC的非细胞治疗奠定了重要基础。
[0005]微囊泡结构exosome是近年来发现的细胞间信号通讯的重要途径，通过细胞外多胞体(MBV)分泌到胞外，是细胞可溶性细胞因子外的重要旁分泌形式，exosome的特征主要有:(1)直径为30-100nm ; (2)具有来源细胞的胞质和脂质膜成分；(3)含有来源细胞特异性蛋白以及相关蛋白如⑶63，⑶9，⑶81等。exosome成分主要包括:microRNA、mRNA，蛋白等，研究表明不同来源的exosome的组成亦有差异，说明其功能的复杂性。由此可见，作为非细胞治疗的重要成分，exosome在促进皮肤损伤修复中具有重要作用。MSC分泌的exosome与MSC相比具有许多优势:(1) exosome通过细胞内吞作用摄入细胞，可以避免一些大分子(如蛋白质，RNA)因细胞膜通道阻挡而不易被细胞吸收的问题，具有生物活性高，作用效率高的优点；(2) exosome在_80°C长期稳定保存，携带的含有生物活性的有效成分受exosome脂质膜保护，不易被破坏，且便于运输和储存；(3)易于掌握临床应用时间，亦易于控制使用浓度、剂量及途径；(4)克服了 MSC在体内存活率低及长期应用突变致瘤的潜在隐患；(5)由于其体积小避免了强烈的免疫排斥等并发症。
[0006]因此，MSC来源的exosome在组织损伤修复中的作用及机制研究就显得特别重要，特别是将脂肪干细胞分泌的exosome进行提取纯化的研究更具有重要的意义。
【发明内容】
[0007]针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用。
[0008]为实现上述目的，本发明公开了促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌多因子载体exosome的制备方法，该方法包括:
[0009]步骤一、取处于对数生长期的第三代到第六代的人脂肪干细胞，待细胞融合至80%后，弃去原培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗2-3遍后，换无血清培养液培养，24h后收集培养上清液；
[0010]步骤二、将步骤一中收集的上清液，在温度4°C、离心力3000g下离心15分钟，离心去除细胞碎片和悬浮细胞，离心后的上清液经0.22um孔径的无菌滤膜过滤得到脂肪干细胞条件培养液；
[0011]步骤三、将步骤二中的条件培养液放入分子量为lOOKDa超滤离心管中，在温度4°C、离心力1000g下离心30分钟，离心浓缩，得到含有exosome的浓缩液；
[0012]步骤四、将步骤三中的浓缩液与Exoquick-TC试剂按照5:1的体积比混合，震荡混匀后，4°C孵育过夜；
[0013]步骤五、孵育过夜后的混合液在温度4°C、离心力1500g下离心30分钟，弃去上清液保留沉淀；
[0014]步骤六、在温度4°C、离心力1500g下对沉淀离心5分钟，吸净残余液体后，用磷酸盐缓冲液重悬，经0.22um孔径的无菌滤膜过滤后_80°C保存，即得多因子载体exosome。
[0015]作为本发明的进一步改进，在步骤一中，所述原培养液内各成分的体积为:88%人脂肪干细胞专用基础培养基、10%胎牛血清、1 %青霉素/链霉素、1 %谷氨酰胺。
[0016]作为本发明的进一步改进，在步骤一中，所述无血清培养液内各成分的体积为:98 %人脂肪干细胞专用基础培养基、1 %青霉素/链霉素、1 %谷氨酰胺。
[0017]本发明还公开了所述多基因载体exosome在促进皮肤创伤愈合中的应用。
[0018]本发明还公开了一种利用人脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome制备的溶剂或针剂，包括上述制备的多因子载体exosome ;所述多因子载体溶解在磷酸盐缓冲液中制成溶剂或针剂；所述多因子载体exosome的含量与磷酸盐缓冲液的使用比例为lug:lul。
[0019]作为本发明的进一步改进，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2?7.4，磷酸盐缓冲液中各成分的含量为 NaCl 137mmol/L，KC1 2.7mmol/L，Na2HP0410mmol/L，KH2P042mmol/Lo
[0020]本发明还公开了所述溶剂或针剂在促进皮肤创伤愈合中的应用。
[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0022]本发明公开的促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用，其制备的用于治疗皮肤损伤的exosome与脂肪干细胞无关，无任何细胞成分，便于运输和储存；与目前现有的超速离心的方法相比，本发明应用离心结合试剂提取的方法得到的exosome产量更高，纯度更好，可以在冰箱中长期保存并保存活性高达1年以上，可以作为细胞治疗的有效替代品，具有极佳的临床应用价值。
【附图说明】
[0023]图1为本发明所述脂肪干细胞分泌的exosome的透射电镜形态学鉴定图；
[0024]图2为本发明所述脂肪干细胞分泌的exosome的标志蛋白⑶63，⑶9western蛋白学鉴定图；
[0025]图3A、3B为本发明所述脂肪干细胞分泌的exosome直径大小的Nanosight (纳米颗粒分析仪)鉴定图；
[0026]其中:图3A为粒子大小/浓度分布图，图3B为动态追踪视频截图；
[0027]图4A、4B为本发明皮肤成纤维细胞(FB)在不同天数不同浓度的exosome刺激下对成纤维细胞增殖速率的影响；
[0028]图5A、5B、5C为本发明中皮肤成纤维细胞(FB)在不同浓度exosome刺激下对成纤维细胞移迀速率的影响；
[0029]图6为本发明皮肤成纤维细胞(FB)在不同浓度exosome刺激72小时后对成纤维细胞中I型胶原的mRNA表达量的影响；
[0030]图7为本发明皮肤成纤维细胞(FB)在不同浓度exosome刺激72小时后对成纤维细胞中III型胶原的mRNA表达量的影响；
[0031]图8A、8B为本发明所述有脂肪层和无脂肪层创口愈合快慢以及exosome标志蛋白⑶63表达情况；
[0032]图9为本发明所述脂肪干细胞分泌的exosome在小鼠皮肤创伤愈合中的体内示踪图；
[0033]图10为本发明所述脂肪干细胞分泌的exosome对小鼠皮肤创伤愈合的影响；
[0034]图11为本发明所述脂肪干细胞分泌的exosome对小鼠皮肤创口愈合快慢的直方图。
[0035]图中:
[0036]CM:培养过脂肪干细胞的条件培养液，作为本实验的一个阳性对照；*:P<0.05 ;#:P〈0.01 ;#木:P〈0.001。
【具体实施方式】
[0037]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0038]下面结合附图1-11对本发明做进一步的详细描述:
[0039]本发明的第一目的在于提供促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌多因子载体exosome的制备方法，该方法包括:
[0040]步骤一、取处于对数生长期的第三代到第六代的人脂肪干细胞，待细胞融合至80%后，弃去原培养液(原培养液内各成分的体积为:88%人脂肪干细胞专用基础培养基、10%胎牛血清、1 %青霉素/链霉素、1 %谷氨酰胺)，用磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液的pH为7.2?7.4，磷酸盐缓冲液中各成分的含量为NaCl 137mmol/L，KC1 2.7mmol/L，Na2HP041 Ommo 1 /L, KH2P042mmo 1 /L)冲洗2_3遍后，换无血清培养液(无血清培养液内各成分的体积为:98%人脂肪干细胞专用基础培养基、1%青霉素/链霉素、1%谷氨酰胺)培养，24h后收集培养上清液；
[0041]步骤二、将步骤一中收集的上清液，在温度4°C、离心力3000g下离心15分钟，离心去除细胞碎片和悬浮细胞，离心后的上清液经0.22um孔径的无菌滤膜过滤得到脂肪干细胞条件培养液；
[0042]步骤三、将步骤二中的条件培养液放入分子量为lOOKDa(厂商Millipore)超滤离心管中，在温度4°C、离心力1000g下离心30分钟，离心浓缩，得到含有exosome的浓缩液；
[0043]步骤四、将步骤三中的浓缩液与Exoquick-TC(SBI的Exoquick-TC外吐小体沉淀物试剂)试剂按照5:1的体积比混合，震荡混匀后，4°C孵育过夜；
[0044]步骤五、孵育过夜后的混合液在温度4°C、离心力1500g下离心30分钟，弃去上清液保留沉淀；
[0045]步骤六、在温度4°C、离心力1500g下对沉淀离心5分钟，吸净残余液体后，用磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液的pH为7.2?7.4，磷酸盐缓冲液中各成分的含量为NaCl137mmol/L，KC1 2.7mmol/L，Na2HP0410mmol/L，KH2P042mmol/L)重悬，经 0.22um 孔径的无菌滤膜过滤后_80°C保存，即得多因子载体exosome。
[0046]对制得的多因子载体exosome进行分析可知，如图1、2、3A、3B所示:
[0047]如图1可知:透射电镜显示提取的e