一种冻干人凝血因子viii的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，设及一种血液制品的制备方法，具体是设及一种冻干 人凝血因子VIII的制备方法。
【背景技术】
[0002] 人凝血因子VIIUFVIII)是人体中最重要的凝血因子之一，在肝脏中合成，有 2332个氨基酸残基，由两条肤链所组成，重链分子量为90-200kDa;轻链分子量为SOkDa， 二条肤链间由Ca2+连接。在人体内的半衰期8-12小时，血浆中的含量仅为0.05 -0.Img/ L。
[0003] FVIII缺乏会导致甲型血友病发生，该病是一种遗传性疾病，患者多为男性，发病 率约1/ 10000-1 /5000，根据血友病的发病率估算，世界血友病患者约40万人，中国血友 病患者人数约为10万人左右。目前登记在册的约1万余人，仅占一成左右。患者出血部 位集中于关节、肌肉和内脏。其中，关节反复出血导致骨骼变形，肌肉萎缩；而内脏和烦内出 血则会危及生命。甲型血友病因属遗传性疾病，目前尚无根治的方法，只能通过输注FVIII 制剂进行替代性治疗，但只要定期输注FVIII制剂，甲型血友病患者完全可W像正常人一 样生活，不会影响工作学习。
[0004] 目前，国内血制品公司供应市场的FVIII产品数量十分有限，不能满足国内甲型 血友病患者的使用要求，经常出现无药可供的情况，严重危害患者的健康和生命安全。国内 目前血制品厂家的FVIII制备工艺得率普遍较低，一般约10万IU/吨血浆（FVIII含量 一般为70-80万IU/吨血浆)，同时产品纯度不高，比活一般不高于50IU/mg，另外，产品的 外观欠佳，冻干粉不成饼状，复溶后乳光严重，有的还有蛋白析出物。 阳0化]鉴于此，本发明开发了一种从冷沉淀中制备冻干人凝血因子VIII的新工艺，克服 了目前生产工艺普遍存在的得率偏低、比活偏低、产品外观较差等缺点，具有流程简单、纯 度高，收率高的优点，可W大规模进行生产。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种生产工艺稳定，产品得率高，质量优良，使 用安全性高的冻干人凝血因子VIII的制备方法。
[0007] 一种冻干人凝血因子VIII的制备方法，包括如下步骤： (1) 冷沉淀溶解并过滤：按1:5-20的重量比，将冷沉淀投入预先配制的溶解缓冲液 中，溫度控制在15-30°C，揽拌2-4小时，使其充分溶解；然后用颇尔公司生产的Supra^r 50P滤板串联0.45化滤忍过滤，收集澄清滤液，过滤前用溶解缓冲液预洗滤板及滤忍； (2) DEAES巧hadexA-50凝胶吸附：W上滤液中加入预先用热的注射用水溶胀并用 平衡缓冲液A平衡的DEAESe地adexA-50凝胶，缓慢揽拌0.5-1. 5小时，后静置5-30分 钟；然后过滤，收集滤液； (3) S/D病毒灭活：W上滤液中加入Tween-80至1.0% (wt%)，TNBP(憐酸S下醋） 至0.3% (wt% )，揽匀后升溫至24-26°C，后保溫6-8小时，然后用0.45化滤忍澄清过 滤，收集滤液； (4) 阴离子交换柱层析：W上滤液上阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液B充分平 衡，上柱结束后，用平衡缓冲液B冲洗柱子，后用洗涂缓冲液洗涂柱子，再用洗脱缓冲液洗 脱柱子，收集洗脱液即为纯化的FVIII溶液，及时用0.45化滤忍进行过滤，收集滤液； (5) 超滤：用超滤膜包浓缩W上滤液，然后恒体积透析4-8倍，再浓缩至凝血FVIII活 力高于35IU/ml;后移出超滤膜包并后洗膜包； (6) 加稳定剂及调节：将FVIII含量稀释至所需值(一般规格为20-30IU/ml)，加入稳 定剂，后调PH值至6. 50-7. 50; (7) 纳米膜除病毒过滤：用0. 1化滤忍串联15-20纳米滤忍进行除病毒过滤； (8) 除菌过滤及分装：用0. 22化滤忍对产品进行除菌过滤并分装； 饼冻干； (10)干热病毒灭活：在100 °C沸水浴中保溫0.5-1小时，进行干热病毒灭活。
[0008] 步骤（1)所述的溶解缓冲液由TRIS(S径甲基氨基甲烧)、氯化钢及水组成，所述 的溶解缓冲液中TRIS的浓度为0. 01M-0. 02M，氯化钢的浓度为0. 075M-0. 15M，所述的溶 解缓冲液的PH值为6. 50-7. 50 ;所述的溶解缓冲液中预先加入肝素钢，肝素钢的加入量为 2000IU-10000IU/吨溶解缓冲液。
[0009] 步骤（2)所述的平衡缓冲液A由TRIS(S径甲基氨基甲烧)、氯化钢及水组成，所 述的平衡缓冲液A中TRIS的浓度为0.02M，氯化钢的浓度为0.075M-0. 15M，所述的平衡 缓冲液A的PH值为6. 50-7. 50 ;所述的DEAES巧hadexA-50凝胶，按溶胀前的干胶计， 加入量为0. 5-1g/kg滤液。
[0010]步骤（4)所述的阴离子交换柱充填的树脂为DEAE Se地arose FF、Capto DEAE 、QSe地arose FF、Capto Q及QSe地arose HP中的任意一种；所述的平衡缓冲液 B、洗涂缓冲液及洗脱缓冲液均由巧樣酸钢、氯化钢、氯化巧及水组成；所述的平衡缓冲 液B中，巧樣酸钢的浓度为0. 01M-0. 02M，氯化钢的浓度为0. 075M- 0. 15M，氯化巧的 浓度为0.005M-0.015M，PH值为6.50-7. 50 ;所述的洗涂缓冲液中，巧樣酸钢的浓度为 0. 01M-0. 02M，氯化钢的浓度为0. 2M-0. 3M，氯化巧的浓度为0. 005M-0. 015M，PH值为 P册.50-7. 50 ;所述的洗脱缓冲液中，巧樣酸钢的浓度为0.01M-0.02M，氯化钢的浓度为 0. 5M-2. OM，氯化巧的浓度为0. 001M-0. 005M，PH值为P册.50-7. 50。
[0011] 步骤巧）所述的超滤膜包的超滤膜截留分子量为10K-30K。
[0012] 步骤化）所述的稳定剂为薦糖、甘氨酸、组氨酸中的一种或几种组合；所述薦糖 的加入量为0.1-3% (wt%)，所述甘氨酸的加入量为0.1-3%(wt%)，所述组氨酸的加入量为 0. 1~3% (wt%)〇
[0013] 本发明的优势在于：（1)本发明采用DEAES巧hadexA-50凝胶吸附去除维生素 K依赖的凝血因子（FII，FVII，FIX，FX)，代替传统的氨氧化侣凝胶吸附或阳G沉 淀，去除效率高，FVIII损失小，得率可达20IU/吨血浆，明显高于传统工艺；（2)本发明 在悬浮液预处理阶段采用压滤法取代离屯、法，避免了离屯、过程中的强剪切力及泡沫，从而 避免了FVIII变性失活，产品更加稳定；（3)本发明所述生产工艺制备的产品，冻干粉为白 色均匀海绵状，复溶时间快，复溶液澄明，无蛋白析出，几乎无乳光；(4)本发明制备的冻干 FVHI产品，干热病毒灭活后，活力损失很少，不大于8%; (5)本发明的生产流程中共采用了S/D病毒灭活、纳米膜过滤去病毒及干热病毒灭活=重病毒灭除措施，对脂包膜病毒、非月旨 包膜病毒及细小病毒进行有效灭除，极大提高了产品的使用安全性。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明制备工艺流程框图。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明；但不能认为本发明的实施方式仅 限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下所 做出的若干简单的改变或替换，都应视为属于本发明权利要求书确定的专利保护范围。
[0016] 实施例一 1，冷沉淀溶解并过滤：将Ikg冷沉淀投入9kg溶解缓冲液中（0. 02MTRIS-H化，0. 15M化化，閒6. 50-6. 60)，溶解缓冲液中预先加入肝素至2000IU/kg，溫度控制在15-20°C， 揽拌4小时，使其充分溶解，然后用PA化公司生产的Supra化r50P滤板串联0.45ym滤 忍过滤，后洗滤忍，最终收集澄清滤液10. 8kg，过滤前用溶解缓冲液预洗滤板及滤忍； 2，DEAES巧hadexA-50凝胶吸附：W上滤液中加入DEAES巧hadexA-50凝胶10.Sg，凝胶加入前用70°CW上的热注射用水溶胀及平衡缓冲液（0.02MTRIS-HCL，0. 15M 化化，閒6. 50-6. 60)预先平衡，加入后充分揽拌1.5小时，然后用滤布过滤，收集滤液，凝 胶再生后重复使用； 3，S/D病毒灭活：W上滤液中加入TweenSO至1.0% (wt%)，TNBP(憐酸S下醋） 至0. 3% (wt%)，揽匀后升溫至24-26°C，后保溫6小时，然后用0. 45ym滤忍过滤，收 集滤液；4,阴离子交换柱层析：W上病毒灭活后的滤液上CaptoQ柱，柱子预先用平衡 缓冲液充分平衡，平衡缓冲液组成为0.02M化-citrate，0.15M化CL，0.OlMCacLz, P册.50-6. 60 ;上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，后用洗涂缓冲液（0. 02M化-citrate ，0. 2M化化，0.OlMCa化2:P册.50-6. 60)洗涂柱子，再用洗脱缓冲液（0. 021M 化-citrate，2.OM化化，0.OOlMCa化2，P册.50-6. 60 )洗脱，收集纯化的FVIII溶液； 5, 用30K分子量的超滤膜（0.IM2)浓缩W上洗脱液，然后恒体积透析4倍，再次浓缩； 后移出超滤膜包并后洗膜包，测得FVIII效价为36. 5IU/ml; 6, 将W上浓缩液稀释至FVIII效价30IU/ml，加入甘氨酸至1.5%(wt%)，后调PH值 至 6. 90-7. 10 ; 7, 用0. 1ym滤忍串联20纳米滤忍进行除病毒过滤； 8, 用0. 22ym滤忍对产品进行除菌过滤并分装； 9, 冻干； 10, 干热病毒灭活：在l〇〇°C沸水浴中保溫30分钟，进行干热病毒灭活。
[0017]实施例二 1，冷沉淀溶解并过滤：将化g冷沉淀投入19kg溶解缓冲液中（0.02M