提高胰岛素及其类似物制备效率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药领域，更具体地说，涉及长效胰岛素类似物甘精胰岛素的制备方法。
【背景技术】
[0002]糖尿病是威胁人类健康的重大疾病，全球发病率逐年上升。胰岛素是治疗糖尿病的关键药物，可有效控制血糖，已经被临床广泛应用和接受。为了满足不同的使用需求，人们研发出了多种胰岛素类似物，在起效时间上为患者提供了多种选择。
[0003]胰岛素及其类似物包含A、B两条肽链，通过二硫键相互连接。在重组表达过程中，胰岛素及其类似物通常以融合蛋白形式存在，即A、B两条肽链之间由连接肽(即C链)连接，纯化并得到构象正确的融合蛋白后，再用特定工具酶对融合蛋白进行水解，去除连接肽。胰岛素及其类似物可用酵母菌或大肠杆菌表达，分别具有优势和局限。酵母菌表达的胰岛素及其类似物以可溶形式分泌到发酵液中，可以直接纯化和酶切，但发酵周期长、成本高。大肠杆菌表达的胰岛素及其类似物以包涵体蛋白形式存在，需要经过复性才能够获得天然构象的前体蛋白，然后再进行酶切，但具有发酵周期短、产量高和成本低的优点。可见酶切是一个重要的工艺步骤，对于原核和真核表达体系的产物普遍适用。
[0004]甘精胰岛素(insulin glargine)是一种长效胰岛素类似物，具有血药浓度平稳、没有峰值和作用时间长的特点，很受患者欢迎。目前，全世界生产甘精胰岛素的企业只有法国的赛诺菲安万特公司和中国的甘李药业。甘精胰岛素的构建是通过在人胰岛素B链C端添加两个精氨酸，同时将A链C端的N21突变成Gly获得的。甘精胰岛素由于具有这样特殊的氨基酸序列，其制备方法，特别是酶切和酶切后纯化工艺，与野生型重组人胰岛素存在很大差别。特别是由于甘精胰岛素中的两个精氨酸紧邻，常规的胰酶和羧肽酶两步酶切法效率较低，错切率较高，而且副产物较多，为后续纯化工艺带来很大负担，显著提高了甘精胰岛素的制备难度和成本。例如，赛诺菲公司的专利申请CN101253196B中提供了一种使用重组猪胰蛋白酶及其变体切割甘精胰岛素前体的方法，酶切效率分别是58.1%和62.9% ;中国专利申请CN 201210532873.8中提供了一种甘精胰岛素前体的酶切转化方法，包括采用牛胰蛋白酶水解甘精胰岛素前体的步骤，其中通过调整酶切反应条件，牛胰蛋白酶的酶切效率可达到86%。
[0005]Kex-2p酶是一个特异性水解两个连续碱性氨基酸后羧基端肽键的蛋白酶，酶切位点是后一个碱性氨基酸的羧基端。Kex-2p酶的使用可显著提高甘精胰岛素融合蛋白的酶切效率，显著降低错切率，为后续纯化工艺带来便利。Nagaraj Govindappa等发明了将Kex-2p酶和甘精胰岛素融合蛋白在酵母工程菌中共表达的技术(专利申请号PCT/IB2012/052853，此处通过援引将其全部内容并入本文)，但共表达工程菌中目的蛋白的表达率受到了很大影响，难以满足大规模生产的需求。此外，该酶是一个糖蛋白，分子量大，经原核表达时复性困难。因此，这种共表达的方法在具有多种优势的原核表达体系中难以实现，使该技术的应用进一步受到限制。
[0006]提高纯化效率是胰岛素及其类似物产业化的一项迫切需求。胰岛素及其类似物例如甘精胰岛素需要长期用药，因此对纯度有很高的要求。同时，该类药物用药量大，纯化收率对于生产成本至关重要。可以用于胰岛素及其类似物纯化介质的大多是离子交换层析介质，如 Q Sepharose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow、Source 30Q、Source 15Q、SPSepharose Fast Flow、CM Sepharose Fast Flow、Nuvia HR_S、Nuvia HR-Q 等。此外，膜岛素及其类似物经过酶切处理后，一般均需要两步纯化:先用离子交换介质纯化一次，再用高压液相层析进行精纯化，采用的介质主要有C8或者C18。因此，通过调整纯化条件提高纯化收率和目的蛋白纯度是本领域技术人员共同的目标。
[0007]羟基磷灰石是一种无机层析介质，由高温烧结的磷酸钙晶体制备而成。根据烧结温度不同，这类介质分为I型和II型，各有20、40和80 μπι三种直径的产品满足不同的层析要求。该类介质载量大，具有独特的分离性能和优越的选择性和分辨率，广泛应用于抗体及抗体片段、各种球蛋白、各种酸性蛋白以及DNA纯化。然而，该介质只能在pH大于6.8的环境下使用，限制了它的应用范围。
【发明内容】
[0008]发明人惊讶地发现，采用羟基磷灰石介质对重组表达的甘精胰岛素前体进行层析纯化时，取得了优越的效果，而且该方法既适用于甘精胰岛素前体包涵体蛋白的纯化，也适用于甘精胰岛素前体复性蛋白的纯化。在本发明的实施例中，目的蛋白纯度可以达到95%甚至98%，大大提高了甘精胰岛素前体的纯化效率，而且便于后续操作。
[0009]本发明一方面提供了一种对重组表达的甘精胰岛素前体进行纯化的方法，其中包括采用羟基磷灰石介质对所述甘精胰岛素前体进行层析的步骤。
[0010]在本发明一个实施方案中，所述方法包括如下步骤:对原核表达的甘精胰岛素前体包涵体采用羟基磷灰石介质进行层析；对获得的甘精胰岛素前体包涵体进行复性；以及对复性的甘精胰岛素前体采用羟基磷灰石介质进行层析。
[〇〇11]在本发明一个实施方案中，所述对甘精胰岛素前体包涵体采用羟基磷灰石介质进行层析步骤的条件为:层析pH 6.5?11，优选pH 6.8?9.5,以及依次用含有NaCl和NaH2P04的层析液进行盐浓度洗脱，其中NaCl的浓度为0.3-2M，NaH孑04的浓度为5-600mM。
[0012]在本发明一个优选实施方案中，所述方法包括如下步骤:在大肠杆菌表达体系中原核表达甘精膜岛素前体，获得甘精膜岛素前体包涵体；对所述甘精膜岛素前体包涵体米用羟基磷灰石介质进行层析，层析条件为:pH 8.0,依次用含有1M NaCl、10mM NaH2P04、50mMNaH2P0# 500mM NaH 2P04的层析液进行盐浓度洗脱；
[0013]对所获得的甘精胰岛素前体包涵体进行复性；并对复性的甘精胰岛素前体采用羟基磷灰石介质进行层析，层析条件为:层析pH 6.5?11，优选pH 6.8?9.5,以及依次用含有NaCl和NaH2P04的层析液进行盐浓度洗脱，其中NaCl的浓度为0.3-2M，NaH 2P04的浓度为 0-300mM。
[0014]在本发明一个优选实施方案中，所述方法包括如下步骤:对所获得的甘精胰岛素前体包涵体进行复性；并对复性的甘精胰岛素前体采用羟基磷灰石介质进行层析，层析条件为:层析 pH 8.0,依次用含有 5〇OmM NaCl、5mM NaH2P04、20mM NaH2P〇dP2〇OmM NaH2P〇J9层析液进行盐浓度洗脱；以及获得纯化的甘精胰岛素前体。
[0015]本发明另一方面提供了一种制备有活性的甘精胰岛素的方法，其中包括采用Kex-2p酶对重组表达的甘精胰岛素前体进行酶切的步骤。
[0016]在本发明一个实施方案中，所述Kex-2p酶的酶切条件为:KeX-2p酶与甘精胰岛素前体摩尔浓度比为1:1000?10000，如:1:2000、3000、5000、8000或10000 ;反应温度O?37。。，如:4、10、15、20、25、37°C ;反应时间 0.5 ?60 小时，可以是:0.5、2、6、12、24、48 或 60小时。在一个优选实施方案中，所述Kex-2p酶的酶切条件为:KeX-2p酶与甘精胰岛素前体摩尔浓度比为1:3000，4°C反应48小时，或25°C反应12小时。
[0017]本发明另一方面提供了一种制备有活性的甘精胰岛素的方法，包括如下步骤:获得重组表达的甘精胰岛素前体；采用Kex-2p酶对所述甘精胰岛素前体进行酶切；使用反相柱对酶切产物进行一步层析纯化，以获得有活性的甘精胰岛素。其中，反相柱可以是C18、C8或C4，反相柱的层析pH为2.5-4.0，如可以用pH 2.5、3.0或4.0。
[0018]在本发明一个实施方案中，所述一步层析纯化采用C8反相柱。在一个优选实施方案中，所述C8反相柱层析的条件为:Buffer A含有0.2M Na2SO4, 50mM H3PO4, ρΗ2.5-4，Buffer B 含有 50% ACN、0.2M Na2SO4, 50mM H3PO4, pH 2.5-4.0，线性梯度洗脱。
[0019]本发明另一方面提供了一种制备有活性的甘精胰岛素的方法，包括如下步骤:在大肠杆菌表达体系中原核表达甘精胰岛素前体，获得甘精胰岛素前体包涵体；对