与几丁质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子及其编码基因、制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，尤其设及与几下质特异结合的碱性成纤维细胞生长因 子及其编码基因、制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 碱性成纤维细胞生长因子化asicfibroblastgrowthfactor;bFGF)，由内皮细 胞、平滑肌细胞、巨隧细胞分泌，是一个传递发育信号，能促进中胚层和神经外胚层细胞分 裂的多肤。bFGF是体内组织损伤修复过程中重要的生长因子，它能够促进新血管的生成、促 进成纤维细胞的增殖病修复损害的内皮细胞。在体外，bFGF能刺激细胞增殖、迁移，诱导纤 溶酶原激活物及胶原酶活性，是与肝素有高亲和力的细胞促分裂原。
[0003]目前，常将bFGF与支架材料混合用于创面修复，其中，最常用的支架材料为几下 质。几下质，又称壳多糖（chitin)，为N-乙酷葡糖胺通过0连接聚合而成的结构同多糖。 几下质，广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中，也存在于一些绿藻 中；主要是用来作为支撑身体骨架，W及对身体起保护的作用。目前，几下质已经广泛的应 用于再生医学领域。它可W(1)促进凝血和伤口愈合；（2)作为药物的缓释基质；（3)用于 组织工程修复。
[0004] 当几下质作为bFGF缓释基质时，bFGF只是混合到几下质中，混合后，几下质和 bFGF通过电荷吸附的机制结合在一起，形成缓释效果。但是几下质与bFGF的运种结合机制 不是很稳定，且结合率很低，因此缓释效果也非常不明显。研究表明，W几下质为支架材料， bFGF会在很短时间内完全释放出来，在原位形成高浓度的bFGF。而高浓度的bFGF并不利 于血管形成和组织再生，而且还有致癌风险。
[0005] 因此，进一步研究具有缓释作用的bFGF制剂十分必要。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供与几下质特异结合的碱性成纤维细 胞生长因子及其编码基因、制备方法与应用。本发明提供的与几下质特异结合的碱性成纤 维细胞生长因子（简称C抓-bFG巧能够与几下质特异性的结合，且结合能力远远高于bFGF， 因而缓释效果也强于bFGF。且经体外实验证实，本发明提供的与几下质特异结合的碱性成 纤维细胞生长因子与天然bFGF具有相似的促进细胞增殖的生物学活性。
[0007] 本发明提供的与几下质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子，包括SEQIDNO: 1 所示的氨基酸序列和SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。
[000引SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列为具有活性的bFGF的氨基酸序列，其中包括154 个氨基酸，其序列具体为AAGSITTLPALP邸GGSGAFPPGHF邸PKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSD PHIKL化QAEERGWSIKGVCANRYLAMKEDG化LASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRS服YTSWYVALKRTGQYK LGSKTGPGQKAI肌PMSAKS。
[0009]SEQIDN0:2所示的氨基酸序列为具有几下质绑定能力的氨基酸序列（化itin BindingDomain,CBD)，其中包括 52 个氨基酸，其序列具体为TTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNG KTYK化QPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ。该氨基酸序列来源于几下质酶，几下质酶W几下质为底物， 催化其水解生成N-乙酷葡糖胺。本发明选择的如SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列能够与 几下质特异性的结合，但是它并不具有几下质酶的酶活性。由于酶与底物的结合关系比电 荷吸附高很多，因此在SEQIDNO: 2的前导作用下，能够使SEQIDNO: 1具有更强的与几下 质特异性结合的能力。因此，本发明提供的C抓-bFGF能够具有较长时间的缓释作用，避免 了在短时间内引起细胞因子浓度升高，从而避免致癌的风险，且不影响bFGF对细胞增殖活 性的促进作用，并且能够降低促进细胞增殖活性所需的浓度。
[0010] 在本发明的实施例中，与几下质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子，包括如SEQ IDNO: 3所示氨基酸序列或SEQIDNO:4所示氨基酸序列。
[OOU]SEQIDNO:3所示氨基酸序列为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列连接在SEQID NO: 1所示的氨基酸序列的氨基端。SEQIDNO:4所示氨基酸序列为SEQIDNO: 2所示的氨 基酸序列连接在SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列的簇基端。本发明将bFGF与几下质酶的 结构域相融合，所形成的融合蛋白能够特异性的与几下质高效结合。而SEQIDN0:2与SEQ IDN0:3的连接顺序并不会影响融合蛋白与几下质结合的效果。
[0012] 在本发明的实施例中，与几下质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子，还包括亲 和纯化标签。
[0013] 在本发明的实施例中，亲和纯化标签为GST标签或His标签。
[0014] 在重组蛋白的亲和纯化中，通常需要利用亲和纯化标签。实验表明、添加亲和纯化 标签并不会影响C抓-bFGF与几下质结合，也不影响C抓-bFGF对细胞活性的促进作用。
[0015] 在一些实施例中，几下质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列如 沈QIDNO:5所示。
[0016] 本发明还要求保护，编码与几下质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的DNA分 子，其包括SEQIDNO:6所示的核巧酸序列和SEQIDNO: 7所示的核巧酸序列。
[0017]SEQIDNO:6所示的核巧酸序列能够表达CBD，而SEQIDNO: 7所示的核巧酸序列 能够表达bFGF。
[0018] 在本发明的实施例中，编码与几下质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的DNA 分子，包括如SEQIDN0:8所示的核巧酸序列或SEQIDN0:9所示的核巧酸序列。
[0019]SEQIDNO:8所示的核巧酸序列为沈QIDNO:7所示的核巧酸序列与沈QIDNO:6 所示的核巧酸序列3'端连接；SEQIDNO:9所示的核巧酸序列为SEQIDNO:7所示的核巧 酸序列与SEQIDNO:6所示的核巧酸序列5'端连接。
[0020] 本发明提供的编码CBD-bFGF的核巧酸序列能够有效表达CBD-bFGF。
[0021] 与几下质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的制备方法为将SEQIDN0:6所示 的核巧酸序列和SEQIDNO:7所示的核巧酸序列经宿主细胞表达，制得与几下质特异结合 的碱性成纤维细胞生长因子。
[0022] 在本发明的实施例中，与几下质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子的制备方法 具体为：将SEQIDN0:6所示的核巧酸序列和SEQIDN0:7所示的核巧酸序列构建入重组 表达载体后转化入宿主细胞，经诱导表达，获得与几下质特异结合的碱性成纤维细胞生长 因子。
[0023] 在一些实施例中，重组表达载体为阳T2化、PET15b、阳T-28a、阳T-28b、阳T-28c或 PET-21a_c。
[0024] 在一个实施例中，重组表达载体为阳T2化。
[00巧]在一些实施例中，宿主细胞为E.COliBL2UDE3)或E.COli化2UDE3)plys。
[0026] 在一个实施例中，宿主细胞为E.COliBL2UDE3)。
[0027] 在一些实施例中，诱导表达的诱导剂为IPTG。
[0028] 在一些实施例中，诱导剂的浓度为0. 2mmol/L~1.Ommol/L。
[0029] 在一个实施例中，诱导剂的浓度为0. 2mmol/L。
[0030] 在一些实施例中，诱导表达的溫度为25°C~37°C，时间为化~12h。
[0031] 在一个实施例中，诱导表达的溫度为37°C，时间为12h。
[0032] 本发明提供的方法能够高效的表达CBD-bFGF。CBD-bFGF的理论分子量为 23619. 82Da，经检测，电泳图中预期位置呈现条带，且条带颜色较深、宽度较大，证明本发明 成功诱导表达了CBD-bFGF。
[0033] 本发明提供的与几下质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子在制备促进细胞增 殖的制剂中的应用。
[0034] 在本发明的实施例中，细胞为Ba化/c3T3细胞。
[0035] 在本发明的实施例中，与几下质特异结合的碱性成纤维细胞生长因子促进细胞增 殖的浓度为llpmol/L~34pmol/L。
[0036] 在一些实施例中，权利要求1所述的与几下质特异结合的碱性成纤维细胞生长因 子促进细胞增殖的浓度为llpmol/L。
[0037] 本发明经过实验证明，采用C抓-bFGF能够对Ba化/c3T3细胞的增殖产生显著的 促进作用，最适浓度为llpmol/L~34pmol/L促进细胞增殖效果最佳的浓度为llpmol/L。 与bFGF相比，CBD-bFGF对Ba化/c3T3细胞增殖促进作用的最适浓度更低，说明本发明提 供的CBD-bFGF比bFGF具有更强的促进细胞增殖的最用。
[0038] 本发明还提供了一种促进细胞增殖的制剂，包括与几下质特异结合的碱性成纤维 细胞生长因子和几下质。
[0039] 实验表明，C