一种海葵溶细胞素Gigantoxin-4单克隆抗体及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学生物工程技术领域，具体涉及一种海葵溶细胞素Gigantoxin-4 单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的多肤、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，W及该单 克隆抗体在用于检测Gigantoxin-4和中和Gigantoxin-4溶血作用中的应用。
【背景技术】
[0002] 我国海域迂阔，海洋生物资源丰富，海上作业频繁。作业人员遭有毒海洋生物伤害 的情况时有发生，有毒海葵垫伤就是一种常见的海洋生物伤。
[0003] 海葵的触手及身体均含有大量的刺细胞，每个刺细胞里都有一个特殊囊状的细胞 器，名为刺丝囊，内储存着毒液，刺丝管盘曲在刺丝囊内，刺丝尖端为刺针，当受到机械或化 学刺激时，会释放刺丝刺入猎物身体并通过刺丝管将毒素注入猎物体内。被海葵整伤后，主 要的症状是受伤局部痛、痒，继而出现红斑、丘疹、専麻疹或疮疹样皮疹。全身症状有焦虑、 情绪低落、恶必等，严重的出现肌肉、气管疫李，必血管功能衰竭和休克等，甚至死亡。对于 海葵垫伤，目前没有较好的治疗方法，只能对对症治疗。
[0004] 海葵毒素，根据分子量W及生物学功能的不同，可W将其分为神经毒素和溶细胞 素两大类。Gigantoxin-4(GT-4)是一种海葵溶细胞素，它的成熟蛋白包含178个氨基酸，分 子量为19kDa(GenBank:JQ353486. 1)。GT-4可W特异性结合细胞膜上的銷磯脂，进一步在 膜上形成孔洞，从而导致细胞溶胀裂解。GT-4具有很高的溶血活性，半数溶血分数约40ng/ ml。给予SD大鼠低剂量（30yg/kg)的GT-4后，必肌收缩力下降导致的全必衰竭是大鼠 死亡的王要原因；而给予局剂量（60yg/kg)的GT-4后，15min内大鼠就因为呼吸巧竭而死 亡。通过组织病理学检查及血液生化指标分析，GT-4能导致SD大鼠的多脏器损伤，如必、 肺、肝、肾均出现不同程度的多灶性出血或坏死，尤W肺最为严重。结合体外实验结果，GT-4 导致SD大鼠的一系列病理变化都是其溶血作用的后果，如果能够找到抑制其溶血作用的 药物或抗体，将会是治疗海葵垫伤的一种重要方法。（参见文献出UB，GuoW，WangLH，Wang JG,LiuXY,JiaoBH.Purificationandcharacterizationofgigantoxin-4,anew actinoporinfromtheseaanemoneStichodactylagigantea.IntJBiolSci.2011; 7 (6): 729-39)。
[0005] 目前尚无海葵溶细胞素Gigantoxin-4抗体的相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种海葵溶细胞素Gigantoxin-4单克隆抗体、用于制备 该单克隆抗体的多肤、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，W及该单克隆抗体的应用。
[0007] 本发明的第一方面，是提供了一种用于制备海葵溶细胞素Gigantoxin-4单克隆 抗体的多肤，氨基酸序列如SEQIDNO;1所示的。
[0008] AspValIleLeuProGluPheValProAsnAsnLys(SEQIDN0：1)
[0009] 本发明的第二方面，是提供了一种海葵溶细胞素Gigantoxin-4单克隆抗体，是由 保藏编号为CCTCCNo;C201473的杂交瘤细胞株分泌产生。
[0010] 本发明的第H方面，是提供了一株杂交瘤细胞株，命名为14853-lhz-5/C377,它的 保藏编号为CCTCCNo;C201473。
[0011] 本发明的第四方面，是提供了一种海葵溶细胞素Gigantoxin-4单克隆抗体的制 备方法，该方法的步骤如下：
[0012] a)合成氨基酸序列如SEQIDNO;1所示的多肤；
[0013] b)将上述多肤作为免疫原免疫小鼠；
[0014] C)取免疫鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；
[0015] d)经多轮筛选出合成多肤反应阳性的细胞克隆，作为抗GT-4蛋白单克隆抗体的 杂交瘤细胞株CCTCCNo;C201473 ;
[0016] e)通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，将腹水进行纯化，得到抗人 GT-4的单克隆抗体。
[0017] 本发明的第五方面，是提供了上述多肤、单克隆抗体、杂交瘤细胞在制备Western Blot或免疫组化检测试剂或试剂盒中的应用，该WesternBlot或免疫组化检测试剂或试 剂盒是用来检测Gigantoxin-4。
[0018] 并进一步提供了上述多肤、单克隆抗体、杂交瘤细胞在制备中和Gigantoxin-4溶 血作用的药物中的应用。
[0019] 本发明提供了抗GT-4的单克隆抗体，该单克隆抗体识别位于GT-4氨基酸序列 DVILPEFVPNNK的抗原表位。
[0020] 本发明单克隆抗体的获得可采用本技术领域常规的方法，即通过在小鼠体内接种 杂交瘤细胞并产生腹水抗体，取出腹水经纯化而得到。
[0021] 本发明的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中必，保藏编号CCTCCNo: C201473,所制备的单克隆抗体是一种免疫球蛋白，可特异性结合GT-4蛋白。
[0022] 本发明还提供单克隆抗体在WesternBlot检测GT-4中的应用。
[0023] 本发明为海葵垫伤的临床个性化治疗应用提供了新的思路。
【附图说明】
[0024] 图1.是单克隆抗体WesternBlot检测GT-4。
[00巧]其中，泳道1是GT-4,泳道2蛋白marker。
[0026] 图2.单克隆抗体中和GT-4的溶血作用。
[0027] 本发明的杂交瘤细胞株，命名为14853-lhz-5/C377,保藏于中国典型培养物保藏 中必（简称CCTCC)，保藏日期2014年6月19日，保藏编号CCTCCNo;C201473,保藏地址： 中国武汉武汉大学。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明 范围的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0029] 实施例1.抗GT-4的单克隆抗体的多肤序列选择和多肤的制备
[0030] 依据GT-4活性位点及跨膜结构分析，选择SEQIDNO;1为抗原表位，委巧艾比玛 特生物医药（上海）有限公司合成多肤，序列如下：
[0031] AspValIleLeuProGluPheValProAsnAsnLys(沈QIDNO; 1)
[0032] 委巧艾比玛特生物医药（上海）有限公司合成多肤将上述多肤连接到相应的载体 上，制备并纯化抗原用于后续免疫反应。
[0033] 实施例2.抗GT-4的单克隆抗体的制备和纯化
[0034] 将实施例1中纯化的多肤抗原用于免疫，免疫8 -12周龄的雌性BALB/c小鼠3只， 采取小鼠快速免疫方式，初次免疫采用双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后双腿进行肌肉 注射，每个区域大约用1/8的免疫原，将剩余免疫原的1/2进行腹腔注射。！周后加强免疫 50Ug，完全弗氏佐剂，腹腔注射。2周后加强免疫50Ug，不完全弗氏佐剂（IFA)，腹腔注射。 3周及W后，每周直接腹腔注射50Ug加强免疫。
[0035] 取化ISA检测效果最好的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞（购自 ATCC)W5:1比例，在阳G1500的作用下，进行融合。融合后的细胞经过适当稀释