一种新的二萜化合物及其制备方法和医药用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体设及从半枝莲的干燥全草中分离得到的一种具有 治疗黑色素瘤作用的二祗化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 半枝莲S州tellariabarbata，又名并头草、狭叶韩信草，为唇形科黄琴属多年生 草本植物，常生于潮湿的池沼、田头、溪涧等地，浙江、江苏、安徽、河南、四川、广东、福建、陕 西等省均有分布。半枝莲性寒，味辛、苦，具有清热解毒、散疲止血、利尿消肿等功效，用于治 疗疗疮肿毒、咽喉肿痛、跌打伤痛、水肿、黄痘、蛇虫咬伤等，是民间常用中草药。
[0003] 半枝莲的化学成分研究始见于1981年王兆全发表在《中草药》的"半枝莲化学 成分研究简报"，至今研究人员通过现代植物化学研究技术从半枝莲中分离鉴定出上百种 单体化合物，主要是黄酬类和二祗类，还有生物碱、酱体、酪类、较质及多糖等成分。黄酬类 化合物是半枝莲的主要成分之一，结构涵盖黄酬、二氨黄酬、二氨黄酬醇、查尔酬等多种类 型。二祗是半枝莲另一类主要化学成分，也是目前研究重点。结构主要为新克罗烧型二 祗，包括半枝莲二祗（SCUtellone)类、半枝莲内醋（scuterivulactone)类、半枝莲生物碱 (S州tebarbatine)类和半枝莲素化arbatin)类等。活性实验显示，二祗类生物碱具有良好 的细胞毒性，能有效抑制多种人肿瘤细胞的生长。
[0004] 现代药理活性研究表明，半枝莲具有良好的抗肿瘤活性，因此作为抗肿瘤和抗炎 药物广泛用于原发性肝癌、肺癌、宫颈癌等恶性肿瘤的辅助治疗。其中野黄琴巧、汉黄琴素、 芹菜素、木犀草素等具有良好的抗菌、抗氧化和抗肿瘤活性。此外，半枝莲还能通过抑制肿 瘤血管生成来阻断人体对肿瘤细胞的供养，从而达到抑制肿瘤细胞增殖和转移的目的。除 上述活性外，半枝莲还具有保肝、抗病毒和利尿排石等活性。
【发明内容】
阳〇化]本发明的目的是提供一种从半枝莲的干燥全草中分离得到的一种具有治疗黑色 素瘤作用的二祗化合物及其制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得W实现的：
[0007] 具有下述结构式的化合物（I)，
[0008]
[0009]所述的化合物（I)的制备方法，包含W下操作步骤：(a)将半枝莲的干燥全草 粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋 和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；化）步 骤（a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用75%乙醇 洗脱8个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步骤化）中 75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1、65:1、30:1、15:1和1:1的二氯 甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用 体积比为25:1、15:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分 2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液等度洗脱， 收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。
[0010] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0011] 进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为80%。
[0012] 一种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I)和药学上可接受的 载体。
[0013] 所述的化合物（I)在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
[0014] 所述的药物组合物在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。
[0015] 本发明化合物用作药物时，可W直接使用，或者W药物组合物的形式使用。
[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、 对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 W及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物W单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】 阳〇1引图1为化合物（I)结构式；
[0019] 图2为化合物（I)理论ECD值与实验ECD值比较；
[0020] 图3为化加免疫巧光检测细胞增殖结果。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可W对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 阳02引实施例1:化合物（I)分离制备及结构确证
[0023] 试剂来源：乙醇、石油酸、乙酸乙醋、正下醇、二氯甲烧为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0024] 制备方法：（a)将半枝莲的干燥全草（8kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取（2^X3 次），合并提取液，浓缩至无醇味（3L)，依次用石油酸（3LX3次）、乙酸乙醋（3LX3次）和 水饱和的正下醇0LX3次）萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物（351g)和正下 醇萃取物；化）步骤（a)中乙酸乙醋萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10 %乙醇洗脱6个 柱体积，再用75 %乙醇洗脱8个柱体积，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物 浸膏（133g) ;(c)步骤化）中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1(8 个柱体积）、65:1 (8个柱体积）、30:1化个柱体积）、15:1 (8个柱体积）和1:1巧个柱体积） 的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（C)中组分4 (31g)用正相硅胶进一步 分离，依次用体积比为25:1 (8个柱体积）、15:1 (10个柱体积）和5:U6个柱体积）的二氯 甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分2 (17g)用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I) (31mg)。 阳0巧]结构确证：HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z499. 1904,结合核磁特征可得分子式为C25H32O9,不饱和度为 10。核磁共振氨谱数据Sh(卵m，DMS0-de，600MHz) 79,t，J= 2. 4)，H-2 (I. 64,m)，H-2 (I. 84,m)，H-3 (I. 11，m)，H-3 (I. 75,m)，H-6(5. 25,s)，H-8(2. 07，d)，H-9(2. 61，t，J= 12. 0)，H-ll(1.35,m)，H-ll(1.99,m)，H-15 巧.93,s)，H-17 巧.54， d，J= 1.8)，H-17 巧.32,d，J= 1.8)，H-18(1.07,s)，H-19(1.03,s)，H-20(l. 11，s)， l-0Ac(2. 04,s)，6-0Ac(2. 14,s)，12-0CH3(3. 02,s)，5-0H(2. 89,br，s);核磁共振碳谱数 据Sc(卵m，DMSO-de，125MHz) :74. 9 (CH，1-0,21. 7 (邸2, 2-0,32.I(邸2, 3-0,38. 3 (C， 4-C)，79. 2 (C，5-C)，77. 0 (CH，6-C)，202. 4 (C，7-C)，48.I(CH，8-C)，36. 5 (CH，9-C)，43.8(C， 10-C)，35. 4(細2, 11-C)，106.6(C，12-C)，166. 0(C，13-C)，139. 4(C，14-C)，115.I(CH， 15-C)，169. 3(C，16-C)，115. 7(邸2, 17-C)，30. 2((?, 18-C)，24. 3((?, 19-C)，16. 4((?, 20-C)，168.8(C，1-OAc)，20. 7 (CH3,1-OAc)，172.I(C，6-OAc)，21. 7 (CH3,6-OAc)，49.6(CH3， I2-OCH3);碳原子标记参见图1。IR谱显示有幾基（1757cmI)信号，W及紫外光谱最大吸 收波长在212nm处，表明该化合物含有a,0-不饱和下締酸内醋部分。締控质子信号 5 册.93化-15,S)和位于低场的碳信号 5C166. 0(C-13)，115.UC-15)和 169. 3(C-16) 也证实了运一结构的存在。另外再结合S个甲基信号5化.07化3-18,3)，1.03化3-19，S)和1. 11化3-2〇,S)，可表明该化合物是一个含有下締酸内醋结构单元的四环二祗类化 合物。HMBC谱中，H-1(5H4. 79,t，J= 2. 4Hz)与-0C0CH3(SC168.8) ;H-6(5 册.25,S) 与-0〇3邸3(5(：172.1);12-0邸3(5册.02,3)与(：-12(5(：106.6)的相关性表明(：-1和(：-6位 连有乙酷氧基，C-12与甲氧基相连。在服QC和HMBC谱中，质子信号5册.54 (d，J=I.細z) 和5. 32化J= 1.細Z)与碳信号（5C115. 7,C-17)直接相连，W及与C-14(SC139. 4)和 C-13( 5C166. 0)长距离的相关性，表明C-14和C-17之间连有双键。综合氨谱、碳谱、HMBC 谱和N犯SY谱，W及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构 型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[0026] 实施例2:化合物（I)药理作用试验
[0027] 一、材料和仪器
[0028] 人A375黑色素瘤细胞株由第S军医大学赠。化合物（I)自制，制备方法见 实施例1，HPLC归一化纯度大于98 %。DMEM培养基、0.25 %膜酶购自美国Gibco公司。 MTT(3-(4, 5-二甲基嚷挫-2)-2, 5-二苯基四氮挫漠盐；四甲基偶氮挫蓝）、DMSO(二甲基 亚讽）、化加购自美国Sigma公司。鼠抗化加多克隆抗体购自美国ABcam公司。山羊抗 鼠二抗购自美国CellSi即aling公司。AnnexinV-門TC/PI细胞调亡检测试剂盒购自美国 Promega公司。
[0029] 恒溫％培养箱，普通冰箱，-80度冰箱均为美国化rma公司产品。超净工作台 (中国苏州净化工程公司）。倒置显微镜，倒置巧光显微镜（Olympus公司）。电热恒溫培 养箱（中国上海跃进医疗器械厂）。自动酶标仪（日本Wako公司）。紫外分光光度仪（美 国Beckman公司）。J6-HC高速离屯、机（美国Beckman公司）。低溫微量离屯、机（德国 Eppendo计公司）。振荡摇床（美国化rma公司）。
[0030] 二、试验方法 阳0川 1、细胞培养
[0032] 1. 1细胞复苏
[0033] 将冻存在液氮罐中的A375黑色素瘤细胞取出，迅速放入37 °C的溫水中，轻