一种抗乳腺癌转移作用的手性紫罗兰酮生物碱衍生物及医药用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种手性紫罗兰酬生物碱衍生物、制备方法及其作为抗乳腺癌转移药 物的应用，属于药物化学研究领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，肿瘤发病率越来越高，已成为危害人们身体健康的头号杀手。而肿瘤转移 是肿瘤治疗的主要障碍，据不完全统计，在确诊的临床肿瘤患者中，大约60%的患者已经出 现转移。肿瘤已成为当今严重威胁人类健康的重大疾病之一。随着生命科学的进步和医学 的发展，人类对肿瘤的认识已经深入到分子细胞层面，各种新的手术治疗手段和化疗药物 不断问世。然而，据美国癌症研究所统计，50余年来，癌症治疗并没有得到根本改观，癌症 死亡率仍然居高不下，主要原因是肿瘤转移，没有肿瘤转移的有效治疗手段和药物。目前世 界公认转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因，大约90%的恶性肿瘤患者死于肿瘤转移。因 此，控制转移是决定肿瘤患者预后的关键因素。
[0003] 化学药物治疗，是原发肿瘤治疗及手术后预防转移的重要治疗手段。几十年的临 床实践表明，化疗药物多药耐药性的发生W及化疗药物非常严重的毒副作用，不仅严重削 弱了化疗效果，而且化疗药物严重损害患者的免疫系统，基本上破坏了抵抗肿瘤细胞侵袭 迁移的第一道屏障，半年内的肿瘤复发率高达69%，运是化学治疗的两难选择。迄今为止， 世界上尚没有抗肿瘤转移药物问世。
[0004] 肿瘤转移是由肿瘤原发部位直接向周围组织扩张和扩散，或者通过血道或淋己道 转移瘤细胞在远端组织落户发展形成新生肿瘤的过程。各种来源的肿瘤细胞在体内的转 移在多数情况下具有其固定的祀器官，即运些具有转移性的肿瘤亚细胞群在控制得很好的 实验条件下会按照一定的过程在特定区域内形成肿瘤转移灶。虽然在不同的肿瘤形成过程 中，肿瘤细胞的基因会发生不同的变化，但是在肿瘤的转移过程大致相同。2001年，Zlotn化 A小组研究发现，细胞的趋化运动在肿瘤细胞的转移和扩散中起着关键的作用。趋化因子 CX化12可W诱导乳腺癌细胞发生趋化运动。如果使用抑制趋化因子CX化12的受体CXCR4 活性的抗体则可W减弱乳腺癌细胞的趋化能力，并抑制其扩散，抑制肿瘤细胞的趋化运动 将能有效地抑制肿瘤细胞的转移和扩散。
[0005] 因此，在干扰或阻断恶性肿瘤在宿主体内播散的过程中，抑制肿瘤细胞的趋化运 动是抗肿瘤转移药物研究中最重要的环节，是延长生存期、提高生存质量和降低死亡率的 最有效手段。另一方面，由于常规原发肿瘤切除后的抗肿瘤转移药物治疗是持续的、长期给 药过程，理想的抗肿瘤转移药物不仅阻断肿瘤细胞在体内的侵袭转移，而且应该是非细胞 毒药物或者毒副作用很低，不会对免疫系统造成损害。鉴于目前抗肿瘤转移化疗药物疗效 的局限性及其毒副作用。从中药中寻找安全性高、且能够有效预防和控制肿瘤转移的药物 越来越受到重视。
[0006] 本研究组发明专利公开了一种抗肿瘤转移作用的转筋草生物碱类化合物（专 利号：201010114809. 9)，在该发明基础上本研究组W活性成分9-(N，N-dimeth}d) -4， 7-megastigmedien-3-〇ne为先导，合成了一系列手性紫罗兰酬生物碱衍生物，并进行了抗 乳腺癌转移活性研究，其中大部分化合物显示了较强的抗乳腺癌转移活性，化合物18-21a， 12b，13b和1化尤为突出。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种具有抗乳腺癌转移作用的手性紫罗兰酬生物碱衍生 物W及所述化合物在用于制备抗乳腺癌转移药物中的用途。
[0008] 本发明是通过下述技术方案加W实现的：
[0009] -方面，本发明提供了一种手性紫罗兰酬生物碱衍生物或其药学上可接受的盐， 其结构如式1和式2所示：
[0010]
[0011] 其中，R选自氨，面素，氯基，径基，节氧基，不同取代位置的氣苯，苯基或取代苯基， 芳香杂环或取代芳香杂环，赃晚基，化咯基，C1-C8的直链或支链面代烷基，6位手性中屯、R 或S型，7,8位为双键或饱和；
[0012] R选自氨、径基、或者不同取代位置的氣苯；
[0013] 所述药学上可接受的盐是指与无机酸或有机酸形成的盐，其中无机酸或有机酸选 自盐酸、氨漠酸、硫酸、憐酸、甲横酸、苯甲横酸、草酸、酒石酸、马来酸、巧樣酸或者抗坏血 酸。
[0014] 本发明提供的一种手性紫罗兰酬生物碱衍生物及其药学上可接受的盐的制备方 法，其主要步骤为：W外消旋a -紫罗兰酬为原料经面仿反应制备化合物Ia和化的外消旋 体混合物，该混合物经手性拆分分别得到光学纯化合物Ia和化，随后通过酷胺化反应，酷 胺还原反应，締丙位氧化反应，还原胺化或亲核取代反应制得目标化合物。
[0015] 本发明的具体合成路线如式3所示：
[0016]
[0017] 合成路线试剂和反应条件；(a)NaOCl，Et0H，0°C tort;似㈱-(+)-1-Phenylethylamine or(S)-(-)-1-Phenylethylamine，EtOAc，re円旭to 4°C ;(c)EDCl，HOBt，阳BA,CH3NH2? HCl，CH2CI2, rt; (cDLiAlHi，THF，40°C ;(e)BoC2〇, NaHO〇3,！HF, rt ;(f)Cr〇3,3,5-dimeth}dprazole，CH2CI2, -20°C ; (g)TFA，CHzClziCTC to ;rt ;(h)parafo;rmaldehyde，NaBHjCN, CHzClziACTC ;(i) substituted fluorobenzyl bromide，K2CO3，DMF，rt ; (j)substituted fluorobenzyl bromide，K2CO3， CH3CN, rt.
[0018] 式3手性紫罗兰酬生物碱衍生物的合成路线
[0019] 另一方面，本发明提供了一种手性紫罗兰酬生物碱衍生物及其药学上可接受的盐 在制备抗乳腺癌转移药物方面的用途。
[0020] 首先，本发明对合成的手性紫罗兰酬生物碱衍生物进行了细胞毒性的测定，进一 步W非细胞毒剂量进行了抗乳腺癌转移活性筛选，所筛选的衍生物化学结构如式3所示：
[0021] 各衍生物对乳腺癌细胞的毒性作用
[002引 MTT比色测定法的原理：此分析方法W还原3-(4,5-二甲基嚷挫-2-基）-2,5-二 苯基四挫漠化物（MTT)为基础，是一种检测细胞存活和生长状况的常用方法。MTT为一种 通用的细胞染色剂，活细胞的线粒体中存在与NADP相关的班巧酸脱氨酶，可将外源性黄色 MlT还原为不溶性的蓝紫色结晶物甲臘（Formazane)，并沉积在细胞中，死细胞此酶消失， MlT不被还原。用DMSO溶解化rmazane后用酶标仪在550nm波长处检测光密度的变化大 小，来衡量测试药物对细胞的生长抑制作用，进而评价细胞毒性。
[002引实验步骤：将培养好的细胞用0. 25%的膜酶消化，吸出膜酶后，用含10% FBS的 培养液终止消化，混匀细胞悬液，计数调节密度为IxlO4,将调好的细胞悬液加于96孔板，每 孔ISOul，置于37°C，5% %的解箱内培养24小时，24小时后加药，每个浓度5个复孔，加 好药后继续置于37°C，5% C02的解箱内培养48小时，之后每孔加5mg/ml的MTT20U1，继续 置于37°C，5% %的解箱内培养4小时，4小时后取出96板，将上清吸出，每孔加IOOul的 DMS0,用酶标仪在570nm波长下测量吸光度。抑制率=(1-加药组OD值/空白组OD值）x 100%
[0024]抗乳腺癌转移活性评价Transwell chemotaxis方法原理：
[00巧]在Transwell小室上腔直接将8 ym孔径滤膜安放在侵袭腔室的上下腔室之间，月中 瘤细胞通过变形运动穿过滤膜，用运种模型能够分析细胞运动能力的大小。在药物筛选时 加入趋化诱导剂（趋化因子EGF)，通过衡量与测试药物共培养的肿瘤细胞和空白组肿瘤细 胞趋化穿过滤膜的细胞数量变化，来表达测试药物抑制肿瘤细胞的趋化迁移能力的大小， 进而评价测试药物抗肿瘤转移的活性强弱。阳性对照为试剂LY294002 ( -种具有抗肿瘤转 移作用的PI3K抑制剂）。
[002引实验步骤：
[0027] 1.样品非细胞毒剂量的筛选：利用MT法筛选出非细胞毒作用的样品浓度。
[0028]2.样品与细胞共培养：将细胞铺于6孔板，置于37°C，5% C〇2的解箱内培养24小 时使其贴壁，24小时后W确定的浓度将样品加于6孔板内，37°C 5% C〇2解箱内共解育24小 时。
[002引 3.趋化实验：将用样品处理过的细胞分别用0. 25%的膜酶消化后，用含10% FBS 的培养液终止消化，该细胞悬液1300巧m离屯、5分钟。将上清倒出，加0. 1 %的BM将细胞 混匀后再次离屯、5分钟后，计数，将细胞密度调成5xl05,放置在解箱内备用。于冰上配置趋 化因子EGF，加于趋化小室的下室，每孔30ul，将包被好的膜铺于下室上，放好胶垫，固定上 室，将之前准备好的细胞悬液加到上室，每孔50ul，每个样品浓度3个复孔，加好后置于0)2 解箱内培养3.化后取出，取出下室，刮去没有趋化过来的细胞，然后用=步染色试剂进行 固定和染色，染色后将膜用石蜡油固定，于显微镜下计数。
[0030] 4.统计计算方法：计数时，每个孔选取5个视野分别计数，取平均值，立个复孔再 取平均即为该样品浓度下的趋化细胞数。数据用SPSS11. 5进行处理，计算半数抑制率ICs。。
[0031] 计算公式：
[0034]实验结果
[0035] 优选化合物对MB-MDA-231细胞（人乳腺癌细胞）趋化抑制的半数有效浓度如表 1所示：
[0036] 表1优选化合物对MB-MDA-231细胞趋化抑制的半数有效浓度
[0038] 抗乳腺癌转移活性评价表明，优选化合物均在非细胞毒剂量下显示出抗乳腺癌转 移活性，其中化合物18-21a，^b，13b和1化尤为突出。
【附图说明】
[0039] 图1 :化合物1化和19a对肿瘤转移相关蛋白intergrin M和PKCC憐酸化水 平的影响A.化合物1化对intergrinP 1和PKC C憐酸化水平的影响；B.化合物1化对 intergrin 0 1和PKC C憐酸化水平的量化分析；C.化合物19a对intergrin 0 1和PKC C 憐酸化水平的影响；D.化合物19a对intergrinP 1和PKCC憐酸化水平的量化分析
【具体实施方式】
[0040] 实施例1.
[0041] 化合物Ia和化的合成方法
[0042] 消旋体化合物1的合成
[0043] 量取20血的a -紫罗兰酬于反应瓶中，加入160血无水乙醇，在30min内于冰浴 下滴加次氯酸钢水溶液500mL。冰浴下揽拌0.化后，再室溫揽拌12h。TLC监测反应完全 (PE : EA=IO : 1)。向反应液中加入IN稀盐酸调节反应液抑值为酸性，二氯甲烧萃取反 应液，萃取=次。收集有机相，有机相用无水硫酸儀干燥，过滤，浓缩后得粗品。粗品经硅胶 柱层析纯化（PE : EA = 10 : 1+0. 3% HAc, V/V)得化合物淡黄色油状物，产率为95. 1%。
[0044] 化合物Ia的手性拆分
[0045]
[0046] 称取化合物1 (消旋体，47. 30g，243. 47mmol)于反应瓶中，加入254mL重蒸乙酸乙 醋，50°C加热使其溶解后，加入（时-(+)-1-苯乙胺（29. 51g，243. 47mmol)，加热回流IOmin 后，待体系稳定至室溫后，将反应瓶转至4°C冰箱，慢慢析出大量白色絮状固体，3化后收 集。把收集后的白色絮状固体依次用重蒸乙酸乙醋W 5. 5%浓度重结晶S次。将最后析出 后结晶溶于二氯甲烧中，室溫揽拌5min后，加入IN稀盐酸调节至PH 1~2,室溫揽拌5min 后，分离有机相，将水相用适量的二氯甲烧萃取=次，合并有机相并用无水硫酸儀干燥，过 滤，减压蒸馈得到黄色油状物，产率为32. 1%。[a投巧62.5 (C 1.042, e化anol)，文献报道 [a技 +367 (C 1.002，e化anol)脚，ee92. 7% .古 NMR(400MHz，CDCl3):56. 92(dd，J = 15. 4Hz， 9. 9Hz，lH，7-H)，5. 81(d，J = 15. 4Hz，lH，8-H)，5. 50(br s，lH，4-H)，2. 31(d，J = 9. 9Hz， 1H，6-H)，2. 04(br s，2H，3-H)，1.57(d，J = 1.5Hz，3H，13-H)，1.47(m，lH，2-H)，1.20(m， ，0. 93(s，3H，11-H)，0. 86(s，3H，12-H). "c 醒 RdOOMHz，CDCI3) : 5 172. 2 巧-C)， 152. 9 (7-C)，131.6巧-C)，122.8巧-C)，121. 7 (4-C)，54. I (6-C)，32. 5 (I-C)，31. I (2-C)， 27. 7 (Il-C), 26. 7 (12-C), 23. 0 (3-0 , 22. 7 (13-C). ESI-MS m/z 217. I [M+Na]
[0047] 化合物化的手性拆分
[0048]
[0049] 参照化合物la的拆分方法，W (S)-(-)-1-苯乙胺作为拆分溶剂，得到黄色油 状物，产率为 34.2%。[a]D -363.7(cl.081，e化anol)，ee 92.9%.? NMR(400MHz，CDCls): 5 6.92(dd，J = 15.2Hz，9.細z，lH，7-H)，5.81(d，J=15.2Hz，lH，8-H)，5.50(brs，lH， 4-H)，2. 31(d，J = 9.細z，lH，6-田，2. 04 化r s，2H，3-H)，l. 57(s，3H，13-田，1.47(m，lH， 2-H)，I. 21 (m，，0. 93(s，3H，11-H)，0. 86(s，3H，12-H). 1化醒RdOOMHz，CDCI3): 5 171. 4 巧-C)，152. 9 (7-C)，131.6巧-C)，122.8巧-C)，121. 5 (4-C)，54. I (6-C)，32. 5 (I-C)， 31. 1(2-0,27. 7(11-0,26. 8(1