用于预防和/或治疗眼科疾病的方法的修饰的TGF-β寡核苷酸的利记博彩app
【专利说明】用于预防和/或治疗眼科疾病的方法的修饰的TGF-β寡核 苷酸
[0001] 本发明涉及用于预防和/或治疗眼科疾病的方法的TGF-β寡核苷酸，其包含桥接 核苷酸，聚环氧烷、2' -氟、2' -0-甲氧基和/或2' -0-甲基修饰的核苷酸。 技术背景
[0002] 转化生长因子β(TGF-β)是一种例如控制增殖或细胞分化的多功能生长因子， 其是涉及发育或组织修复的生理或病理过程中调控眼组织中细胞行为的最重要配体之一， 虽然还涉及多种其他生长因子。该配体活性增加可诱导不利的炎性应答和组织纤维化。在 哺乳动物中，已知三种TGF-β的同种型，S卩β1、β2和β3。在大多数情况中，TGF-β增强 胞外基质生产并抑制细胞增殖。此外，TGF-β能够诱导多种生长因子，即结缔组织生长因 子（CTGF)、血小板衍生生长因子（PDGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)和血管内皮生长因子 (VEGF)以及TGF-βΙ本身。所有这些因子都在损伤后的正常组织恢复中具有重要作用。
[0003] 润湿内部眼结构（角膜内皮、虹膜、晶状体、小梁网和视网膜）的水状液含有多种 细胞因子和生长因子。TGF-β(特别是TGF-I3 2)是主要的细胞因子。生理上，TGF-β主 要以潜伏、无活性的形式产生于睫状体上皮和晶状体上皮，该形式由成熟TGF-β、潜伏相 关肽（LAP)(小潜伏形式）和潜伏-TGF-β-结合蛋白（LTBP)组成。已在人和动物中报道 了晶状体中各TGF-β同种型的异质性表达模式。在多种眼科疾病的临床期间，水状液中 TGF-β2的浓度发生变化。例如，在具有增殖性玻璃体视网膜病变（PVR)(-种后视网膜脱 落和视网膜纤维化的疾病）的眼中，玻璃体中TGF-β2的浓度随着视网膜纤维化的进展而 升高。与正常对象相比，糖尿病性视网膜病变和开角型青光眼的患者中总TGF-β2和活性 TGF-β2的浓度也较高。在糖尿病性视网膜病变中，视网膜微血管的慢性阻塞诱导VFGF上 调和巨噬细胞的趋化作用（TGF-β的主要来源KVEGF和TGF-β联合诱导视网膜新血管形 成和围绕这些新血管的纤维化，这会潜在导致视网膜脱落或出血。升高的TGF-β2水平诱 导小梁网细胞中基质表达和沉积，导致青光眼中排水路径的阻塞和眼内压的升高。在各实 施例中，TGF-β都在疾病发生中起作用。在具有假性表皮脱落综合征（pseudoexforiation syndrome)(-种类型的青光眼，其在晶状体、虹膜或小梁网上具有表皮脱落材料沉积）的 眼中，TGF-β1的水平升高，但TGF-β1在该疾病发病机理中的确切作用仍然未知（参见 ShizuyaSaika,LaborartoryInvestigation(2006)，86, 106-115)〇
[0004]TGF-β是胞外基质产生和沉积的最有力调控因子之一。其通过两种主要机制刺 激胞外基质的产生并影响其粘附性质。首先，TGF-β刺激成纤维细胞和其他细胞产生胞外 基质蛋白和细胞粘附蛋白，包括胶原、纤连蛋白和整联蛋白。其次，TGF-β减少降解胞外基 质的酶（包括胶原酶、肝素酶和间质溶解素）的产生，并增加抑制降解胞外基质的酶的蛋白 质（1型纤溶酶原激活物抑制剂和金属蛋白酶的组织抑制剂）的产生。这些变化的净作用 是增加胞外基质蛋白的产生并以细胞特异性方式提高或降低细胞的粘附性质（参见Blobe GC等，2000 年 5 月，〃Roleoftransforminggrowthfactorbetainhumandisease(人 疾病中转化生长因子β的作用）〃，N.Engl.J.Med. 342 (18)，1350-1358)。
[0005] 已提出靶向TGF-β作为例如青光眼中的潜在治疗性措施。考虑到 TGF-β在青光眼发病机理中的多个方面，治疗应涉及调节其产生、激活、与受体相 互作用、下游胞内调节机制和/或最终结构和ECM变化（参见PrendesMA等，BrJ Ophthalmol(2013)，97, 680-686)。
[0006] 基于慢性增加的眼内压，青光眼（GCM)是一种以视网膜神经节细胞的进行性 缺失为特征的进行性视神经病变，其在临床上体现为视神经盘神经视网膜边缘组织缺 失、视网膜神经纤维层中的缺陷和功能性视域测试的缺陷（参见Danesh-Meyer等， Ophthalmol. 2006, 113:603-611)。青光眼是美国成人中失明的第二大主要原因。虽然有多 种治疗选择（包括难治患者中的手术过程），但失明仍是一种主要威胁。原发性开角型青光 眼（P0AG)是美国国内青光眼的最常见形式。在世界范围内，2000年时患有P0AG的人数预 测为6680万人，其中670万人双侧失明（参见Quingley，BrJOphthalmol. 1996年5月； 80(5) :389-393) 〇
[0007] 白内障手术是最常见的眼科手术过程。仅仅在美国，每年进行最多300万例白 内障手术。目前美国政府每年花费超过30亿美元用于治疗白内障（仅医保患者）。通 过手术移除眼的晶状体，并植入眼内晶状体。晶状体囊维持在原位，且该囊的前半部 分经常由于机械破坏和晶状体替换相关的其他潜在因素而发生后囊膜混浊（PC0)。该 病症出现在20至40 %的PC0患者中，在最初的两年内进行YAG-激光后囊膜切开术 (比率取决于国家、使用的晶状体类型和手术经验）以除去混浊（参见JohanssonB 等，BrJOphthalmol(2010) ,94, 450-455;MathewRG等，OphthalmicSurgLasers Imaging(2010)，41，651-655)。使用YAG-激光与各种风险相关，包括视网膜脱落（1-3% )、 黄斑水肿（最高5%)和继发性青光眼（参见BillotteC和BerdeauxG，JCataract RefractSurg(2004), 30(10), 2064-2071)〇
[0008]TGF-β与GCM和PC0的病理生理密切相关；迄今为止，已通过ALK5抑制剂（例 如参见W0 2009/146408)或针对TGF-β的抗体（即其同种型之一，其公开于例如TO 2012/167143)来抑制TGF-β蛋白的作用。迄今为止，这些化合物无一能够成功地在眼中抑 制TGF-β并因此成功预防和/或治疗诸如GCM或PC0的眼科疾病。
[0009] 本发明的目的是提供一种寡核苷酸，优选反义寡核苷酸，其特异性抑制TGF-β1、 TGF-β2 和 / 或TGF-β3mRNA，TGF-β1 和TGF-β2mRNA或TGF-β1 和TGF-β3mRNA或 TGF-β2和TGF-β3mRNA的表达，并因此能够高度有效地用于预防和/或治疗眼科疾病而不 导致任何（严重的）副作用。
【发明内容】
[0010] 本发明涉及使用一种TGF-β寡核苷酸（优选TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3 反义寡核苷酸）的用途，其用于治疗眼科疾病（干眼病、青光眼或后囊膜混浊）的方法中。
[0011] 该TGF-β寡核苷酸由SEQIDNO. 1的TGF-β1核酸序列（参见图1)或SEQID Ν0· 2的TGF-β2核酸序列（参见图2)或SEQIDΝ0· 3的TGF-β3核酸序列（参见图3) 的10-20个（优选12-18个）核苷酸组成，该寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修饰 的。本发明的一些寡核苷酸对应于TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，或TGF-β1和TGF-β2或 TGF-β1和TGF-β3或TGF-β2和TGF-β3,且与这些序列中的一种或多种杂交。
[0012] 具体而言，用于本发明的寡核苷酸包含SEQIDNO. 2的第1380-1510号核酸区域 的10-20个（优选12-18个）核苷酸或由其组成，该寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经 修饰的。这些寡核苷酸分别在降低和抑制TGF-β2表达和活性方面高度有效。优选的寡核 苷酸包含或由以下序列组成：SEQIDN0. 5 (如ASPH36:GACCAGATGCAGGA)、SEQIDN0. 6 (如 ASPH80:GCGACCGTGACCAGAT)、SEQIDNO. 7(如ASPH98:GCGCGACCGTGACC)，SEQIDNO. 8(如 ASPH111:AGCGCGACCGTGA)，或SEQIDΝ0·9(如ASPH121 或ASPH153:GACCGTGACCAGAT)、 SEQIDN0·10(如ASPH15:CTGCCCGCGGAT)、SEQIDN0·11(如ASPH17:TCTGCCCGCGGAT)、 SEQIDΝ0·12(如ASPH26 或ASPH27:GGATCTGCCCGCGGA)、SEQIDΝ0·13(如 ASPH37:CTTGCTCAGGATCTGCC)、SEQIDNO. 14(如ASPH52 或 53:GCTCAGGATCTGCCCGCGGA)、 SEQIDN0·15(如ASPH112:GGATCGCCTCGAT)、SEQIDN0·16(如ASPH119:CCGCGGATCGCC)， 或SEQIDNO. 34(如ASPH30:CGATCCTCTTGCGCAT)。
[0013] 在另一个实施方式中，本发明涉及一种寡核苷酸，其包含SEQIDNO. 2的TGF-β2 核酸序列的第2740-2810号核酸区域的10-20个（优选12-18个）核苷酸或由其组成，该 寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修饰的。这些寡核苷酸分别在降低和抑制TGF-β2 表达和活性方面高度有效。优选的寡核苷酸包含或由以下序列组成：SEQIDN0. 60(如 ASPH65:TCTGAACTAGTACCGCC)、SEQIDΝ0·76(如ASPH82:AACTAGTACCGCCTTT)，或SEQID NO. 106(如ASPH115:CTAGTACCGCCTT)。
[0014] 在另一个实施方式中，本发明涉及一种寡核苷酸，其包含SEQIDN0.2的 TGF-β2核酸序列的第1660-1680号核酸区域的10-20个（优选12-18个）核苷酸或 由其组成，该寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修饰的。这些寡核苷酸分别在降低 和抑制TGF-β1和/或TGF-β2表达和活性方面高度有效。优选的寡核苷酸包含或 由以下序列组成：SEQIDN0. 17(如ASHP01 或ASPH02:ACCTCCTTGGCGTAGTA)、SEQID NO. 18(如ASPH03 或ASPH04:CCTCCTTGGCGTAGTA)、SEQIDNO. 19(如ASPH05、ASPH06 或 ASPH07:CTCCTTGGCGTAGTA)，或SEQIDΝ0· 20(如ASPH08:TCCTTGGCGTAGTA)。
[0015] 在另一个实施方式中，本发明涉及一种寡核苷酸，其包含SEQIDNO. 2的TGF-β2 核酸序列的第2390-2410号核酸区域的10-20个（优选12-18个，最优选13个）核苷酸或 由其组成，该寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修饰的。这些寡核苷酸分别在降低和抑 制TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3表达和活性方面高度有效。优选的寡核苷酸包含或由 以下序列组成：SEQIDΝ0. 21 (如ASPH9 或ASPH10:CAGAAGTTGGCAT)。
[0016] 在另一个实施方式中，本发明涉及一种寡核苷酸，其包含SEQIDNO. 2的TGF-β2 核酸序列的10-20个（优选12-18个）核苷酸或由其组成，该寡核苷酸中的一个或多个核 苷酸是经修饰的。这些寡核苷酸分别在降低和抑制TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3 (且 最优选TGF-β2)表达和活性方面高度有效。优选的寡核苷酸包含或由以下序列之一组成： SEQIDΝ0. 22-59、61-75、77-105、107-140 (例如ASHP11-ASPH14、ASPH16、ASPH18-ASPH25、 ASPH28-ASPH35、ASPH38-ASPH51、ASPH60-ASPH64、ASPH66-ASPH79、ASPH81、ASPH83-ASPH97、 ASPH99-ASPH110、ASPH113、ASPH114、ASPH116-ASPH118、ASPH120、ASPH122-ASPH152、 ASPH154-ASPH183,或T-LNA(SEQIDN0:144))。
[0017] 本发明中优选的寡核苷酸分别是ASPH01、ASPH03、ASPH05、ASPH17、ASPH22、 ASPH26、ASPH27、ASPH35、ASPH36、ASPH37、ASPH45、ASPH47、ASPH48、ASPH65、ASPH69、ASPH71、 ASPH80、ASPH82、ASPH98、ASPH105、ASPH115、ASPH190、ASPH191、ASPH192和ASPH193。
[0018] 本发明中其他优选的寡核苷酸是表1所示的ASPH1000至ASPH1132,其优选抑制 TGFf3 ImRNA的表达和/或活性。该组中优选的寡核苷酸分别是例如ASPH1047、ASPH1051、 ASPH1059、ASPH1106、ASPH1139、ASPH1150、ASPH1162、ASPH1163、ASPH1175、ASPH1178和 ASPH1181。
[0019] 在替代性实施方式中，寡核苷酸优选抑制TGFi3 3mRNA的表达和/或活性。这 类寡核苷酸分别是例如ASPH2000、ASPH2001、ASPH2002、ASPH2003、ASPH2004、ASPH2005、 ASPH2006、ASPH2007、ASPH2008、ASPH2009、ASPH2010、ASPH2011、ASPH2012、ASPH2013、 ASPH2014、ASPH2015、ASPH2016、ASPH2017、ASPH2018、ASPH2019、ASPH2020、ASPH2021、 ASPH2022、ASPH2023、ASPH2024、ASPH2025、ASPH2026、ASPH2027、ASPH2028、ASPH2029、 ASPH2030、ASPH2031、ASPH2032、ASPH2033、ASPH2034、ASPH2035、ASPH2036、ASPH2037、 ASPH2038、ASPH2039、ASPH2040、ASPH2041、ASPH2042、ASPH2043、ASPH2044、ASPH2045、 ASPH2046、ASPH2047、ASPH2048、ASPH2049、ASPH2050、ASPH2051、ASPH2052、ASPH2053、 ASPH2054、ASPH2055、ASPH2056、ASPH2057、ASPH2058、ASPH2059、ASPH2060、ASPH2061、 ASPH2062、ASPH2063、ASPH2064、ASPH2065和ASPH2066。
[0020] 本发明的寡核苷酸显示对TGF- β 1、TGF- β 2或TGF- β 3,或TGF- β 1和TGF- β 2 的意料之外的强且特异性抑制。或者，本发明的寡核苷酸显示对TGF-β 1和TGF-β 3或 TGF- β 1和TGF- β 2或TGF- β 2和TGF- β 3,并在另一情况下显示对TGF- β 1、TGF- β 2和 TGF-β 3的强且特异性抑制。
[0021] 本发明的核苷酸中的一个或多个核苷酸的修饰选自LNA、ΕΝΑ、聚环氧烷（如三甘 醇（TEG))、2'_氟、2'-0_甲氧基和2'-0_甲基。这些修饰优选位于寡核苷酸的5'和/或 3'端。包含这类修饰的核苷酸的寡核苷酸是修饰的寡核苷酸。
[0022] 修饰的核苷酸是排列为例如一列（彼此紧邻）或不同的模式（此时一个或多个未 修饰的核苷酸在一个修饰的核苷酸后）。例如，寡核苷酸以一个或多个修饰的核苷酸起始， 随后是一个或多个（如一个、两个、三个或四个）未修饰的或未锁定的（unlocked)核苷酸， 随后再是一个或多个修饰的核苷酸。在一个实施方式中，该核苷酸的两端都包含相同模式 的修饰的和未修饰的或未锁定的核苷酸。在另一个实施方式中，3'和5'端的修饰模式不 同，包括一端不包含修饰的核苷酸。优选地，修饰的寡核苷酸包含一系列8或9个未锁定的 核苷酸。
[0023] 或者，该寡核苷酸中任何其他位置的核苷酸，或者该寡核苷酸的5'和/或3' 端处和该寡核苷酸中的任何其他位置的至少一个核苷酸是经修饰的。例如，ASPH1071、 ASPH1100、ASPH1109、ASPH1110、ASPH1111、ASPH1115、ASPH1126、ASPH1127和ASPH1128属 于一组TGF-β寡核苷酸，例如TGF-β 1寡核苷酸，其包含处于不同模式（例如由未锁定的 核苷酸隔开彼此）中的修饰的核苷酸（如LNA、ENA等）。这些寡核苷酸包含一种类型的修 饰，或一种或多种不同的修饰。任选地，寡核苷酸的两个连续核苷酸（修饰或未修饰的）之 间的至少一个磷酸连接是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。在优选的实施方式中，本发明的寡核 苷酸是硫代磷酸酯。
[0024] 此外，本发明涉及TGF-β反义寡核苷酸，其与超过一种TGF-β同种型相互作用并 抑制其表达，即使在寡核苷酸与TGF- β 1、TGF- β 2和/或TGF- β 3序列非100%互补的情况 下也是如此。这类反义寡核苷酸分别是例如ASPH1024、ASPH1096、ASPH1131和ASPH1132。 这些寡核苷酸优选与相同或不同物种（如人、猴、大鼠或小鼠）的TGF-β序列相互作用，例 如分别是ASPH1131 和ASPH1132。
[0025] 不同实施方式的所有寡核苷酸均用于预防和/或治疗眼科疾病的方法，这些眼 科疾病是例如干眼病、青光眼、后囊膜混浊（PC0)、成视网膜细胞瘤、脉络膜癌、马凡或洛伊 斯-迪茨综合征、黄斑变性（如衰老相关的黄斑变性、糖尿病黄斑水肿或白内障）。
【附图说明】
[0026]图 1 显示人 TGF-βImRNA 的核酸序列（ΝΜ_000660· 4)。
[0027]图 2 显示人 TGF-β 2mRNA 的核酸序列（ΝΜ_003238· 3)。
[0028]图 3 显示人 TGF-β 3mRNA 的核酸序列（ΝΜ_003239· 2)。
[0029] 图4显示核苷酸修饰的示例。
[0030] 图5a)至5c)显示人Α172神经胶质瘤细胞中TGF-β1和TGF-β2mRNA表达的抑 制。以10nM的剂量使用不同的修饰的寡核苷酸转染A172细胞（在转染试剂存在的情况 下），并在转染后24小时测量TGF-β1 (白色柱）和TGF-β