一种在酸性条件下诱导表达的启动子的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种在酸性条件下诱导表达的启动子，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 黑曲霉是重要的工业生产菌，作为生物反应器广泛应用于酶、抗生素、有机酸等物 质的生产。同时，黑曲霉是食品安全级菌株，具有广阔的应用前景。传统的对黑曲霉的改造 方法是诱变和筛选，但这种不定向的诱变使得筛选的工作量巨大，而且并不一定可以筛选 到优良性状的转化子。随着黑曲霉基因组测序工作的完成，转录组数据不断对黑曲霉基因 组表达谱进行挖掘，黑曲霉的代谢网络模型不断得到完善，黑曲霉高产柠檬酸机制和高效 分泌蛋白的机制得到更深层次的阐述。在此基础上，通过分子改造对黑曲霉的代谢进行调 控来实现目的产物的积累已经有成功的报道。
[0003] 目前对黑曲霉进行代谢改造，大多利用组成型启动子（PgpdA、Pmbf)来启动基因 表达，在菌体生长阶段，这些基因就已经开始表达，因此不利于基因工程菌的生物量的积 累。诱导型启动子则包括糖化酶基因（gla)启动子、木聚糖酶基因（xln)启动子和乙醇脱氢 酶（ale)启动子等，这些启动子都需要在培养基中特异添加相应的底物来诱导基因表达， 而且表达强度不如组成型启动子，此外xln启动子受到葡萄糖的抑制，gla启动子的表达强 度则受葡萄糖浓度的影响而变化，无法在主要碳源为葡萄糖的培养基中稳定地进行高强度 表达外源基因。考察黑曲霉生产柠檬酸的发酵过程，柠檬酸在pH〈3时开始积累，因此，需要 在菌体生长阶段，尽可能不表达外源基因，而在菌体产酸阶段，大量表达外源基因。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了酸诱导的启动子，解决了区分菌体生长和菌体 产酸这两个阶段的问题，使外源基因可以只在产酸阶段大量表达，为霉菌发酵生产有机酸 以及其它需要在酸性条件进行发酵生产的产品提供了有效的方法和新的思路。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种酸诱导的启动子，所述启动子的核苷酸序列是：
[0006] (l)SEQIDNO. 1 或
[0007] (2)与SEQIDNO. 1的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列；或
[0008] (3)在SEQIDNO. 1的基础上进行碱基插入和/或缺失得到的，具有驱动和/或调 节表达功能的核苷酸序列。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述启动子的核苷酸序列SEQIDN0. 1，命名为 Pgas〇
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述酸诱导指的酸性环境是指pH2左右。
[0011] 本发明的第二个目的是提供启动子在调控基因表达方面的应用。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述应用是在霉菌中诱导基因的表达。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述应用，是将含有所述启动子的遗传构建体转化 到霉菌细胞中，在酸性条件下进行培养；所述遗传构建体中的启动子与异源核酸序列连接， 异源核酸序列受启动子的调控。
[0014] 本发明还要求保护含有所述核苷酸片段或者所述启动子的遗传构建体、表达载 体。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述遗传构建体含有本发明的启动子、与本发明的 启动子有效连接的异源核酸序列、3'转录终止子。
[0016] 本发明还要求保护含有所述启动子的重组菌。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是将依次含有启动子、异源基因序列、终 止子的表达框转化到宿主细胞中得到的。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌、藻类、真菌、酵母、植物、昆虫 或动物宿主细胞中的任意一种。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是按照如下方法构建得到的：（1)合成 或者扩增得到SEQIDNO. 1的酸诱导启动子片段（命名为Pgas)，将启动子、异源基因序列 (即想要调控表达的基因）、trp终止子依次连接载体上，构建重组质粒；（2)从重组质粒上 扩增得到依次含有启动子、异源基因序列、终止子的表达框，然后将表达框转入宿主菌中， 筛选阳性克隆子，即为重组菌。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌为黑曲霉，所述异源基因为GFP。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述黑曲霉为H915-1。
[0022] 本发明的有益效果：
[0023] 本发明成功地从黑曲霉中克隆获得一个酸诱导启动子，并提供了一种仅在酸性条 件下启动基因表达的方法，为代谢改造黑曲霉发酵生产有机酸和其它酸性条件下合成的产 品奠定了 一定的基础。
【附图说明】
[0024] 图1所示为Pgas和PgpdA启动下的GFP在不同pH下的荧光；
[0025] 图2所示为不同pH下各转化子的GFP焚光强度；gpdA、pth、aat、patl、gas分别 代表以启动子PgpdA、Ppth、Paat、Ppatl、Pgas控制GFP基因表达的转化子。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1 :黑曲霉基因组DNA的提取
[0027] 将黑曲霉孢子接种到ME液体培养基中，35°C250r/min培养48h，用mirocloth收 集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻。用液氮研磨的方法将组织充分 磨碎，采用QIAGEN公司DNeasyPlantMiniKit提取丝状真菌基因组。
[0028] 实施例2 :酸诱导启动子的获取
[0029] 对NCBIGEODatasets中黑曲霉在不同pH下的转录组数据（Series号GSE11725) 进行分析，找到4个基因的表达量随pH下降而增加，将黑曲霉基因组序列中这四个基因的 上游约 1. 5kb喊基序列提交到Berkeleymodels(http://www.fruitfly.org/seq_tools/ promoter,html)进行启动子预测，均可以找到核糖体结合位点，预测到4个启动子Pgas、 Ppatl、Ppth、Paat〇
[0030] Pgas通过引物gas-F和gas-R(序列分别如SEQIDNO. 2、SEQIDΝ0· 3)进行扩增， 两端含有Eco RI和Sma I酶切位点。Ppatl通过引物pat-F和pat-R(序列分别如SEQID NO.4、SEQID NO. 5)进行扩增，两端含有Sac I和Bam HI酶切位点。Ppth通过引物pth-F 和pth-R(序列分别如SEQID NO.6、SEQID NO. 7)进行扩增，两端含有Sac I和Bam HI酶 切位点。Paat通过引物aat-F和aat-R(序列分别如SEQID NO.8、SEQID NO. 9)进行扩 增，两端含有Eco RI和Bam