10 μ g/mL)，10天后固定，Giemsa染色后拍照。如图1所示，LM3细胞在5 μ g/mL浓度无克隆形成；LM_0R细胞对5_10 μ g/mL奥沙利铂均可生长并形成集落，说明LM3-0R细胞可较好的耐受奥沙利铂。
[0030]实施例2:耐药细胞株形态学观察
[0031]取对数生长期的人高转移肝癌细胞株LM3和奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-0R，于10 μ g/mL培养液中生长72小时后，倒置显微镜下观察细胞形态，结果如图2所示:相比于LM3细胞，LM3-0R细胞生长良好，呈梭形，有的甚至成线状。
[0032]实施例3:细胞生长曲线测定
[0033]将人高转移肝癌细胞株LM3和奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-0R分别消化、计数，按照3000个/孔接种于96孔板，分别培养24、48、72、96小时后，每孔加入CCK8(碧云天，N0.C0037)，孵育 2 小时。570nm 酶标仪(Model 680, B1-Rad)测吸光度。LM3及LM3-0R细胞生长曲线见图3。
[0034]实施例4:细胞侵袭实验测定
[0035]用Matrigel(BD 公司，N0.356234)按 1:7 稀释后，取 75 μ L 包被 Transwell 上室，置于37°C下4小时。将人高转移肝癌细胞株LM3和奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-0R分别用胰酶消化、离心，加DMEM培养基制成含2X 104细胞悬液500 μ L，加入Transwell (Corning公司，N0.3422)上室中，下室中加入含10%胎牛血清培养液500 μ L。放A5% C02、37°C培养箱常规培养12小时后固定，Giemsa染色，于倒置显微镜下拍照。LM3-0R较LM3细胞侵袭能力增强(结果见图4)。
[0036]实施例5细胞基因表达谱芯片检测
[0037]本实验选用Agilent人表达谱芯片4X44K(design ID:014850)，芯片包含了超过41，000人类基因和转录本。RNA质检合格后，参照Afilent表达谱芯片标准流程进行反转录成双链cDNA，再进一步合成用Cy3标记的cRNA，芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner扫描得到原始图像，采用Feature Extract1n软件处理原始图像提取原始数据，利用Genespring软件进行quantile标准化处理。
[0038]表达谱差异分析结果表明，LM3与LM3-0R细胞相比，共发现差异(P005FC2)基因264个，其中上调(LM3-0R/LM3)基因46个，下调基因218个。实验重点分析了与耐药相关的基因，发现ABC转运体(ABC transporters)、细胞周期(Cell cycle)、细胞凋亡(Apoptosis)、上皮细胞间质转型(Epithelia-mesenchyme transit1n)、药物代谢-脂质合成(Drug metabolism-lipid synthesis)通路发生显著富集，尤其ABC转运体通路基因发生明显变化，呈现上调(给药组/对照组)趋势，ABCB、CASP、MAPK相关基因在通路中处于重要调控地位，证明了奥沙利铂对耐药肿瘤细胞杀伤的重要机制。
[0039]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1.一种奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株，名称为奥沙利铂耐药的人高转移肝癌细胞株LM3-0R，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号是C2014164。2.如权利要求1所述的奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株的建立方法，其特征在于，以人高转移肝癌细胞株LM3为诱导对象，采用持续诱导法建立奥沙利铂耐药的人高转移肝癌细胞株LM3-0R。3.如权利要求2所述的奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述持续诱导法的具体步骤包括: 第一步:将人高转移肝癌细胞株LM3复苏后，用培养液培养至对数生长期，用奥沙利铂药物进行诱导，所述诱导的方法为:将对数生长期的细胞用培养液培养至40% -60%贴壁率时加入奥沙利铂，初始浓度为0.4-0.6 μ g/mL，继续培养，并维持该药物浓度直至细胞能稳定生长、传代； 第二步:将传代细胞用培养液培养至对数生长期，重复采用第一步所述的诱导方法进行诱导，但逐步提高所加入奥沙利铂的初始浓度，直至细胞能在含8.0-12.0 μ g/mL浓度的奥沙利铂的培养液中稳定生长、传代及复苏，此时的细胞株即为奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-OR。4.如权利要求3所述的奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株的建立方法，其特征在于，第一步和第二步中的所述培养液为含10-15%胎牛血清的DMEM培养液。5.如权利要求4所述的奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株的建立方法，其特征在于，所述DMEM培养液中还含有青霉素100-200U/mL和链霉素100-200 μ g/mL。6.如权利要求3所述的奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株的建立方法，其特征在于，第一步和第二步中的细胞培养温度为37°C，培养气氛中C02浓度为5%。7.如权利要求3所述的奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株的建立方法，其特征在于，第二步中所述的奥沙利铂的初始浓度的逐步提高方式为:先以每次增加0.5-1 μ g/mL的方式增加奥沙利铂的浓度；待奥沙利铂浓度增加至4-6 μ g/mL时，再以每次增加1-1.5 μ g/mL的方式增加奥沙利铂的浓度。8.如权利要求3所述的奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株的建立方法，其特征在于，第二步中所述奥沙利铂的初始浓度的逐步提高方式为:将奥沙利铂的初始浓度依次改为1.5 μg/mL、2.5 μg/mL、3.5 μg/mL、4.5 μg/mL、5.5 μg/mL、7 μg/mL、8.5 μg/mL、10 μg/mL。9.权利要求1所述的奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株在肿瘤研究中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株及其建立方法。所述奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号是C2014164。所述奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株的建立方法以人高转移肝癌细胞株LM3为诱导对象，采用持续诱导法建立奥沙利铂耐药人高转移肝癌细胞株LM3-OR。通过本发明建立奥沙利铂耐药人肝癌细胞株可用于构建体内、外肿瘤耐药模型，为肝癌揭示耐药机制、逆转耐药出现、开发新的抗癌药物提供了实验基础。CCTCC NO：C201416420140924
【IPC分类】C12N5/09, C12N1/36
【公开号】CN105274057
【申请号】CN201510706447
【发明人】樊嘉, 徐泱, 胡博, 孙海香, 汤卫国, 周俭
【申请人】复旦大学附属中山医院
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年10月27日