一种高细胞毒活性的cik细胞的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞免疫领域，具体涉及一种高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002] 免疫治疗作为肿瘤综合治疗的第四种模式，越来越受到重视。肿瘤免疫治疗主要 包括肿瘤疫苗治疗、细胞因子治疗、过继性细胞免疫治疗及单克隆抗体免疫治疗等。肿瘤 疫苗是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机 体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发。用于抗肿瘤研究的细胞因子主要有干扰素 类、白细胞介素类、集落刺激因子类等，其中以IFN-α、IL-2、粒-巨噬细胞集落刺激因子为 多。过继性细胞免疫包括淋巴细胞因子活化的杀伤细胞、自然杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细 胞、DC-CIK等。单克隆抗体免疫疗法的现有研究结果表明，肿瘤分子靶向治疗具有较好的 安全性和有效性，如小分子表皮生长因子受体（EGFR)、酪氨酸激酶抑制剂、抗EGFR单克隆 抗体、抗血管内皮生长因子单克隆抗体以及其他分子靶向治疗药物，已在临床中取得较好 的疗效。
[0003]目前用于肿瘤细胞免疫治疗的免疫活性细胞主要有肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL)、 树突状细胞（DC)以及细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK)等。CIK细胞是一种杀伤力强的免疫 活性细胞，其主要效应细胞的表面标志为CD3+CD56+，与其他过继性免疫治疗细胞相比，具有 增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点。但是，肿瘤病人免疫功能受损，免疫细胞功能减 弱，因此，来源于肿瘤病人外周血制备的CIK细胞杀伤肿瘤能力低下，影响CIK细胞疗效。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法，利用正常健 康人单个核细胞库诱导制备CIK细胞，获得的CIK细胞具有很强的增殖力，CD3+、CD8+和 ⑶3+⑶56+细胞的比例高，并且对肿瘤治疗效果优异。
[0005] 上述目的是通过如下技术方案实现的：
[0006] -种高细胞毒活性的CIK细胞的制备方法，包括如下步骤：（1)取患者外周血，收 集外周血的单个核细胞部分；（2)将步骤（1)收集的外周血的单个核细胞部分离心，弃去上 清液，获得单个核细胞；（3)取单个核细胞按照1X106/mL细胞，加入含500~2000IU/mLγ 干扰素和80~120ng/mLTurrapubinΑ的完全培养基，开始诱导培养；其中，完全培养基， 包括含体积百分比为10%FBS的RPMI1640细胞培养液；（4)步骤（3)的细胞培养20~28 小时后，加入50~1000ng/mL抗人CD3单克隆抗体和500~2000IU/mL重组人IL-2,继续 诱导培养，其中，每隔2~3天传代培养一次，整个诱导培养的时间为13~21天，获得CIK 细胞。
[0007] 进一步地，步骤（1)中所述收集外周血的单个核细胞部分的方法为：(a)患者外周 血中，加入1~1. 5倍体积的不含血清的细胞培养液或pH7. 2PBS缓冲液稀释，充分混匀；其 中，细胞培养液包括：RPMI1640培养液和頂DM培养液；(b)将步骤（a)获得的血液稀释液 加入到淋巴细胞分离液的界面上；（c) 1500~2500转/分钟，离心15~20分钟，收集中间 层，获得单个核细胞。
[0008] 进一步地，步骤（1)中所述收集外周血的单个核细胞部分的方法为：患者经采用 血细胞分离机上的淋巴细胞采集程序，单采集患者的外周血单个核细胞。
[0009] 进一步地，步骤（2)中，离心的转速为1000~1500转/分钟，离心的时间为7~ 10分钟。
[0010] 进一步地，步骤（4)所述继续诱导培养为每2~3天用含500~2000IU/mL重组 人IL-2的完全培养基或含500~2000IU/mL重组人IL-2和100~500IU/mL重组人IL-1 完全培养基传代培养。
[0011] 上述任一所述制备方法制备的CIK细胞。
[0012] -种含有上述CIK细胞的细胞制剂。
[0013] 上述CIK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0014] 本发明的有益效果：本发明提供的制备方法可以获得高纯度、高增殖力和高细胞 毒活性的CIK细胞，可用于肿瘤的细胞免疫治疗。
【附图说明】
[0015] 图1为外周血单个核细胞诱导制备的CIK细胞生长曲线图；
[0016] 图2为外周血单个核细胞诱导制备的CIK细胞的杀伤肿瘤细胞活性图。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。
[0018] 以下实施例中，所用的原料或试剂除特别说明外，均为市售可得。
[0019] 另外，以下实施例中，涉及的完全培养基为含10% (体积百分比）FBS的RPMI 1640培养液；冷冻保护剂是含10% (体积百分比）DMS0的培养基，其中，该培养基是由70% (体积百分比）RPMI1640培养液和20% (体积百分比）FBS(胎牛血清）所构成。
[0020] 实施例1 :CIK细胞的诱导制备和检测
[0021] 一、CIK细胞的诱导制备
[0022] (1)取患者外周血30mL加入等体积RPMI1640培养液（Invitrogen公司），充分 混匀。
[0023] (2)将步骤⑴获得的倍比稀释的外周血60mL，加入到30mL淋巴细胞分离液（上 海华精生物高科技有限公司）（比重1. 077)的界面上（不要破坏界面），以2000转/分钟， 离心20分钟，取中间层-富含淋巴细胞的白膜层，加入完全培养基20mL。取少量细胞进行 细胞计数及苔盼兰活细胞计数染色，结果显示，活细胞达99%。
[0024] (3)将步骤⑵获得的含有完全培养基的白膜层，以1000转/分钟，离心10分钟， 弃上清液，沉淀为单个核细胞。
[0025] (4)加入完全培养基，细胞计数，用完全培养基调整单个核细胞浓度为1X106/mL。
[0026] (5)按照 1X106/mL细胞，加入γ_IFN(Peprotech公司）和TurrapubinA(自 制，制备方法见文南犬BioactiveLimonoidandTriterpenoidConstituentsofTurraea pubescens，J.Nat.Prod.，2013, 76,1166-1174)使其浓度分别为lOOOIU/mL和 100ng/mL，置 37°C、5% 0)2培养箱中，开始诱导培养。
[0027] (6)步骤（5)的细胞培养24小时后，在培养的细胞中，加入500ng/mL抗人CD3单 克隆抗体（Biolegend公司）和 1000IU/mL重组人IL-2(P印rotech公司），置 37°C、5%C02 培养箱中，继续诱导培养，从而获得CIK细胞。CIK细胞鉴定方法：细胞数量扩增，⑶3+⑶56+ 双阳性标志细胞数量升高，杀伤肿瘤细胞能力增强（非MHC限制性）。
[0028] 其中，单个核细胞中加入γ-IFN和TurrapubinA，经培养24小时后（诱导第1 天），光镜观察发现，细胞活化透亮，折光性强。在单个核细胞中加入抗人CD3单克隆抗体和 重组人IL-2,经培养24小时后（诱导第2天），光镜观察发现，细胞聚集，并且有很多小集 落开始形成，细胞明显增大。
[0029] (7)诱导培养的第四天，细胞传代。按照1份CIK细胞原液，加入3份含1000IU/ mL重组人IL-2的完全培养基。同时，取样检测CIK细胞扩增倍数，流式细胞仪检测⑶3、 ⑶56、⑶4、⑶8阳性细胞数，检测CIK细胞杀伤K562肿瘤细胞（中国科学院细胞库）活性。
[0030] (8)此后，每3天按照上述方法，传代一次，并做相同的检测。诱导培养的第19天 终止培养。以上方法均在严格无菌环境内进行。
[0031] 其中，在诱导第7天时，肉眼下即可观察到白色斑点，光镜下观察发现，细胞集落 明显增多、增大，大集落成黑团，看不清细胞形态，周边游离细胞饱满折光性好，大小形态各 异。
[0032] 二、按照以上方法进行诱导制备CIK细胞的相应检测结果
[0033]1、检测CIK细胞扩增倍数
[0034] 检测方法为：按1X106单个核细胞/孔，接种在24孔板内，按照上述方法进行诱导 制备CIK细胞和细胞换液，第7天开始换成25平方厘米细胞培养瓶培养，对诱导的第0、4、 7、10、13、16、19天，取11^样本，通过血细胞计数仪（日本光电公司，1^1(-6410?)，进行(：11( 细胞扩增倍数检测，取5次试验结果的平均值