细胞的回收方法及用于该方法的加工骨的利记博彩app
【专利说明】
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及使用骨的外表面被包被剂包被的加工骨的细胞的回收方法及该加工骨。
【【背景技术】】
[0002]骨，一般而言，其表面被骨膜覆盖。骨膜的内侧由骨质(致密质及海绵质)构成，在骨质的内侧有被称为髓腔的被骨髓填满的内腔。在骨髓中存在各种类的细胞，这些细胞被总称为骨髓细胞。
[0003]骨髓被作为造血器官为人所知，在骨髓细胞中含成熟及未成熟的血液细胞、以及造血干细胞。所以，为免疫学研究或毒性试验等的目的，进行着从实验动物的骨采集骨髓。
[0004]在狗及猴等的大动物的情况中，可在麻醉下由骨髓穿刺针从骨直接采集骨髓。另一方面，在大鼠及小鼠等的小动物的情况中，可摘出大腿骨而切除骨的两端部(骨端)，通过使用带注射针的注射器从截面向骨内注入胎牛血清(FBS)等的液体，使骨髓流出而采集(参照例如，Kakiuchi S.等人，J.Toxicol.Sc1.，vol.29，N0.2，p.101-111，2004)。
【
【发明内容】
】
[0005]【发明要解决的技术课题】
[0006]本发明人将通过向骨的内部注入液体而回收骨内的细胞的上述方法应用于从大动物摘出的骨。即，本发明人，从猪摘出的大腿骨中，纵向隔开间隔而开2个孔，从一个孔导入生理盐水，试着从另一孔回收含细胞的液体。结果，令人惊讶地，从孔不太回收得到含细胞的液体，其几乎全部自骨的表面漏出。如此，本发明人新发现，在由向骨内的液体的导入的细胞的回收方法中，由于液体自骨的表面漏出，无法以高收率回收骨内的细胞。
[0007]【解决课题的技术方案】
[0008]本发明人经锐意研究的结果发现，由向在骨的内部的液体的导入回收骨内的细胞的方法中，通过用包被剂覆盖骨的外表面，可抑制含细胞的液体从骨的外表面漏出，从而完成本发明。
[0009]本发明提供细胞的回收方法。此方法包括以下的工序。
[0010](1)通过加工自活体采集的骨，制备加工骨的工序、
[0011]其中上述加工骨的上述骨的外表面由紧密附着于骨的外表面的包被剂包被，并且有贯通上述包被剂及上述骨的外表面而到达上述骨的内部的第1及第2孔，
[0012](2)从上述第1孔向加工骨内导入液体的工序、及
[0013](3)从上述第2孔回收含细胞的液体的工序。
[0014]另外，本发明提供上述的方法中使用的加工骨。此加工骨是，
[0015](1)上述加工骨由从活体摘出的骨制备，
[0016](2)上述骨的外表面由上述紧密附着于骨的外表面的包被剂包被，
[0017](3)具有用于向骨内导入液体的第1孔和用于回收含细胞的液体的第2孔，
[0018](4)上述第1及第2孔贯通上述包被剂及骨的外表面而到达骨的内部。
[0019]【发明效果】
[0020]由本发明，在由向骨的内部导入液体的回收骨内的细胞的方法中，使抑制含细胞的液体从骨的表面漏出，有效回收细胞成为可能。
【【附图说明】】
[0021]【图1】是对本实施方式的细胞的回收方法适宜的灌流系统的模式图。
[0022]【图2】是在实施例1中，向用聚二甲基硅氧烷(PDMS)包被的加工骨导入生理盐水时的照片。
[0023]【图3】是在比较例1中，向未包被的猪大腿骨导入生理盐水时的照片。
[0024]【图4】是在实施例2中，向用PDMS包被的加工骨导入生理盐水时的照片。
[0025]【图5】是在比较例2中，向未包被的猪大腿骨导入生理盐水时的照片。
[0026]【图6】是在实施例3中，向用环氧油灰包被的加工骨导入生理盐水时的照片。
[0027]【实施方式】
[0028]以下参照附图描述本发明的优选的实施方式。
[0029]本实施方式的细胞的回收方法(以下，也简称为“方法”)是从上述的加工骨的第1孔导入液体，从第2孔回收含细胞的液体的方法。本实施方式的方法可用手动方法实施，也可由使用送液栗等的灌流系统实施。适宜于本实施方式的方法的灌流系统之一例示于图1。图1所示的灌流系统主要由用包被剂102包被的骨101 (加工骨)、灌流液瓶201、送液栗202、回收瓶301、连接它们的管401?407、以及三通活塞501及502构成。在图1中，箭头示作为灌流液的液体流的方向。
[0030]在图1所示的灌流系统中，可从导入口 A经管404将任意的成分添加到液体。例如，可将细胞添加到液体而向骨内导入，观察回收后的该细胞的变化等。从而，在用本实施方式的方法回收的细胞中，不仅骨髓细胞，也含自外部添加的细胞。自回收口 B可采样回收瓶301中回收的含细胞的液体。以下，对本实施方式的方法的各工序进行说明。
[0031]在本实施方式的方法中，首先进行制备骨的外表面由紧密附着于骨的外表面的包被剂包被，并且有贯通包被剂及骨的外表面而到达骨的内部的第1及第2孔的加工骨的工序。
[0032]制备成加工骨的骨也可为鱼类、两栖类、虫类、鸟类及哺乳类之任何的动物的骨，在它们之中，特别优选除人之外的哺乳类的骨。作为那样的哺乳类的动物，优选为用于动物实验的动物或家畜，例如，可举出猪、牛、马、山羊、绵羊、猴、狗、猫、兔、猪鼠、大鼠、小鼠等。
[0033]骨的种类不特别限定，如果是硬骨，则也可使用长骨、短骨、扁平骨及不规则骨的任何的种类的骨。作为长骨，例如，可举出上腕骨、桡骨、尺骨、中手骨、大腿骨、胫骨、腓骨、中足骨等。作为短骨，例如，可举出手根骨、足根骨等。作为扁平骨，例如，可举出头顶骨、胸骨、肋骨、肠骨等。作为不规则骨，例如，可举出椎骨、肩甲骨等。
[0034]在本实施方式的方法中，制备成加工骨的骨优选使用刚从动物摘出之后的骨。骨的摘出后不立即实施本实施方式的方法时，也可冷藏摘出的骨。冷藏温度可为一般温度、例如可为4°C。摘出后立即冷藏保存时，优选在摘出后1天以内使用。从动物摘出骨的方法本身是现有技术中公知的。
[0035]加工骨的制备工序包括将骨用包被剂包被的工序，及向骨开第1及第2孔的工序。在本实施方式中，进行包被骨的工序和向骨开第1及第2孔的工序的顺序不特别限定。例如，也可将骨用包被剂包被之后，贯通该包被剂及骨的外表面而向骨开到达骨的内部的孔。或者，也可在骨上开到达内部的孔之后，不堵塞该孔而用包被剂包被该骨。首先在骨上开孔时，将该骨用包被剂包被之前，例如，可通过将与孔有相同的直径的管或棒、优选注射针插入各孔，确保孔不被包被剂堵塞。
[0036]加工骨的第1及第2孔是贯通包被剂及骨的外表面而到达骨的内部的孔。在本实施方式中，骨上的孔的位置不特别限定。例如，向长骨的骨干等被骨膜覆盖的部分开孔时，第1及第2孔成为贯通包被剂及作为骨的外表面的骨膜而到达骨的内部的孔。另一方面，在骨的关节面无骨膜，关节面被关节软骨覆盖。从而，向骨的关节面开孔时，第1及第2孔成贯通包被剂及作为骨的外表面的关节软骨而到达骨的内部的孔。再有，向骨开孔的手段不特别限定，使用针或钻等的工具即可。
[0037]在本实施方式中，第1孔的深度优选为自此孔导入的后述的液体与骨髓接触成为可能的深度。另外，第2孔的深度优选为从此孔回收后述的含细胞的液体成为可能的深度。作为那样的第1及第2孔的深度，例如，是达骨质的深度，优选为达海绵质的深度，更优选为达髓腔的深度。
[0038]第1及第2孔的大小只要是液体的导入及含细胞的液体的回收是可能的大小就不特别限定。例如，第1及第2孔的直径是，为了液体的导入及含细胞的液体的回收而是与使用的管或注射针相同的直径即可，可将直径在0.3mm以上2.1mm以下的范围内适宜设定。
[0039]在本实施方式的方法中，由于向骨的内部导入液体而回收细胞，在第1孔和第2孔之间优选有一定的距离。第1孔和第2孔之间的距离根据骨的大小适宜决定即可。例如，在大腿骨等的长骨的情况中，可在接近一侧骨端的骨干部分开第1孔，在接近反对侧的骨端的骨干部分开第2孔。
[0040]在本实施方式中，第1及第2孔可为各自各1个，也可为多个。第1及第2孔的数可互相相同，也可不同。
[0041]在本发明中，包被剂通过紧密附着于骨的外表面，为了抑制要从第2孔回收的液体及细胞自骨的外表面漏出而使用。从而，包被剂只要是共具可紧密附着于骨的外表面、且可抑制从骨的外表面的液体及细胞的漏出的2个性质的物质、材料或制品，就不特别限定。作为那样的包被剂，例示有现有技术中公知的树脂、粘接剂、高分子膜、凝胶、石膏等。在本发明中，从这些包被剂之中可使用1种或2种以上。
[0042]在本实施方式中，骨内的细胞与后述的液体一同回收，所以包被剂优选有不透过水的性质。另外，骨干燥，则骨内的细胞有损伤的可能性，所以包被剂优选在骨的外表面湿的状态下也可紧密附着于骨。
[0043]在本实施方式中，只要包被剂和骨的外表面无隙间相接，则包被剂和紧密附着于骨的外表面的原理或形态等不特别限定。即，包被剂和骨的外表面可仅简单密接，也可机械结合，也可物理或化学地相互作用。作为机械结合，可举出通过包被剂流入骨的外表面的微小的凹部而固化的锚定效果。作为物理的相互作用，可举出由范德华力的结合及静电相互作用等。作为化学相互作用，可举出形成共价键或离子键的化学相互作用等。另外，在骨的外表面部