一种维氏硝化杆菌及硝化细菌-反硝化细菌复合菌剂及生产方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物及环境工程领域，具体涉及一种维氏硝化杆菌及硝化细菌-反 硝化细菌复合菌剂及生产方法和应用。
【背景技术】
[0002] 水作为人类赖以生存的资源，在不断污染的同时又亟待进行治理。随着生物修复 方法愈来愈被人类所重视，硝化细菌及反硝化细菌的应用也逐渐提升到一个新的高度。
[0003] 微生物脱氮主要通过硝化-反硝化的过程实现，其中硝化过程的主要承担者为硝 化细菌，而反硝化过程的主要承担者为反硝化细菌。硝化细菌分为氨氧化细菌和亚硝酸盐 氧化细菌两大类，在有氧气存在的条件下它们可以将氨氮转化为硝酸盐氮；在无氧或低氧 的条件下，通过反硝化细菌的反硝化作用，将硝酸盐氮转化为气态的N20或N2从水体移出， 最终实现水体中氮素的脱除。
[0004] 由于硝化细菌为无机化能自养型细菌，其生长缓慢，工业化生产困难，而且单一的 硝化细菌并不能实现水体氮素的完全脱除，应用过程中往往造成大量的总氮积累，为了有 效消除总氮，人们往往通过后期投加反硝化细菌的方式实现脱氮。而目前正规的自养硝化 细菌均为液体菌剂，反硝化细菌为固体菌剂，两种菌剂产品采用不同的生产工艺生产，无法 实现混合发酵或者简单复合，这两类菌剂的分开生产和应用在一定程度上增加了菌剂的生 产成本和应用的难度。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了一种维氏硝化杆菌，该菌株已于2014年5月14日，送 往中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：维氏硝化杆菌（NitrobacterWinogradskyi) Y3-2,CCTCCNO:M2014203,地址：中国武汉武汉大学。
[0006] 本发明还有一个目的在于提供了维氏硝化杆菌（NitrobacterWinogradskyi) Y3-2的应用，该菌剂可以快速消除水体中的亚硝酸盐，能有效消除水产养殖水体中亚硝酸 盐积累，促进养殖动物健康生长，也可用于污水处理厂中，促进硝化作用，提高污水处理厂 脱氮效率。
[0007] 本发明还有一个目的在于提供了一种硝化细菌-反硝化细菌复合菌剂，该菌剂包 括欧洲亚硝化单胞菌（ATCC19718)，维氏硝化杆菌Y3-2(CCTCCNO:M2014203)和施氏假单 胞菌（ATCC17588)。
[0008] 本发明的还有一个目的在于针对硝化细菌-反硝化细菌培养过程中遇到的问题 及实际应用中的困难，提出了一种硝化细菌-反硝化细菌菌剂混合培养的方法，方法简单， 易行。
[0009] 本发明最后一个目的在于提供了一种硝化细菌-反硝化细菌复合菌剂的应用，该 菌剂可有效脱除水体中的氮素，达到净化水质的目的。
[0010] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0011] 一种维氏硝化杆菌，通过以下方式得到：
[0012] 维氏硝化杆菌菌株是发明人于2008年在武汉市龙王庙污水处理厂活性污泥中 富集、分离、纯化得到。该菌株已于2014年5月14日，送往中国典型培养物保藏中心保 藏，分类命名：维氏硝化杆菌（NitrobacterWinogradskyi)Y3_2,保藏编号：CCTCCN0: M2014203,地址：武汉武汉大学。
[0013] 维氏硝化杆菌Y3-2细胞呈长杆状，细菌形态见图1所示。革兰氏阴性。严格化能 自养型，只能通过氧化亚硝酸盐获得能量。生长需要严格好氧，pH6. 5-8. 5,生长温度范围 为10-40°C，最适生长温度为30°C，属于淡水硝化细菌，可耐受盐的浓度范围为0_15000mg/ L。该菌具备高效消除Ν02-Ν的能力，单独发酵的培养菌液，硝化速率可以到达800-3000mg N02-N/L/h，通常为1000mgN02-N/L/h，按照万分之一至十万分之一的量（体积比）接种污染 水体，可使水体亚硝酸氧化速率达到l-5mgN02-N/L/h。
[0014] -种维氏硝化杆菌的应用，包括其在水产养殖中的应用，以及污水处理中的应用。 在水产养殖中用于消除水体亚硝酸盐积累，改良水质，从而促进了养殖动物生长；在污水处 理厂中用于促进水体硝化作用，加速了污水硝化-反硝化脱氮过程。
[0015] -种硝化细菌-反硝化细菌菌剂，该菌剂包括欧洲亚硝化单胞菌，维氏硝化杆菌 和施氏假单胞菌。
[0016] 优选的，所述菌剂的各组分的配比为：欧洲亚硝化单胞菌：维氏硝化杆菌：施氏假 单胞菌为 1X1〇7-5X10scfu/ml: 1X107-5X10scfu/ml: 1X10s-lX109cfu/ml。
[0017] 优选的，所述的欧洲亚硝化单胞菌为ATCC19718,为一种自养氨氧化细菌。
[0018] 维氏硝化杆菌为维氏硝化杆菌Y3-2,CCTCCNO:M2014203。
[0019] 施氏假单胞菌为ATCC17588,为一种反硝化细菌。
[0020] 一种硝化细菌-反硝化细菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0021] A、配制硝化细菌混合培养基；
[0022] B、按照培养基体积的2% -20 %的量接种欧洲亚硝化单胞菌，每隔6_12h补料 (NH4)2S04或NH4C1，使培养基中NH4-N终浓度维持在75-255mg/L范围内，培养3-4天；培养 温度25-35°C，搅拌转速为150-250rpm;
[0023] C、在步骤B的基础上，按照初始硝化细菌混合培养基体积的2 % -20 %的量接种维 氏硝化杆菌，并继续按照步骤B的方法继续补料培养1-2天，培养温度25-35°C，搅拌转速为 15〇-250rpm；
[0024] D、补料培养硝化细菌结束后，在硝化细菌培养物的基础上加入反硝化有机营养 液，并接种施氏假单胞菌；接种量为初始硝化细菌混合培养基体积的1% _5%，培养温度 25-35°C，接种后24h内搅拌转速为150-250rpm，24h后静置培养，当检测发现培养液中硝酸 盐和亚硝酸盐浓度均为〇mg/L时，发酵结束。
[0025] 所述的硝化细菌混合培养基的配方包括：NaCl0· 3g/L，MgS04 · 7H20 0· 04g/ L，FeS04 0· 0396g/L，（NH4)2S04 0· 5g/L，K2HP04 · 3H20 4. 108g/L，KH2P04 0· 272g/L，pH 7. 5-8. 5,其余为水。
[0026] 所述的反硝化有机营养液的配方包括：乙酸钠20_40g/L;酵母膏、酵母浸粉、酵母 提取物或酵母浸膏其中一种或组合5_20g/L，其余为水。
[0027] 所述的在硝化细菌培养物的基础上加入反硝化有机营养液，其特征在于，添加的 反硝化有机营养液是初始硝化细菌混合培养基体积的5% -20%。
[0028] 优选的，所述的欧洲亚硝化单胞菌为ATCC19718
[0029] 维氏硝化杆菌为维氏硝化杆菌Y3-2,CCTCCNO:M2014203。
[0030] 施氏假单胞菌为ATCC17588。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0032] ①维氏硝化杆菌Y3-2具有高效消除Ν02-Ν的能力，硝化速率可以达到 800-3000mgN02-N/L/h，通常为1000mgN02-N/L/h，而现有硝化细菌亚硝酸氧化能力通常低于 500mgN02-N/L/h〇
[0033] ②在制备硝化细菌-反硝化细菌复合菌剂中，本发明缩短了发酵时间，具有更高 的发酵生产效率。本发明方法采用氨氧化细菌ATCC19718、亚硝酸盐氧化菌Y3-2、反硝化细 菌ATCC17588分阶段连续混合培养的方式，可以有效缩短其培养时间，培养时间由之前3种 菌单独培养总共需要14天缩短至6天，缩短57%，提高了生产效率。
[0034] ③本发明充分利用了培养基组分，可以有效降低生产成本。硝化细菌培养过程中 将氨氮转化为亚硝酸盐，进而转化为硝酸盐，硝酸盐又被反硝化细菌利用，一部分作为氮 源，一部分转为为氮气脱除。其他微量元素都可以被上述3种微生物共同利用。
[0035] ④本发明得到的聚合体产品培养液中最终基本不含无机氮，不会因为在污水中大 量使用该菌剂而将无机氮带入水体中，增加水体N素污染程度。
[0036] ⑤本发明方法最终得到一种硝化细菌-反硝化细菌复合菌剂，该复合菌剂能实现 完整的硝化-反硝化过程，相比于单一的硝化细菌或反硝化细菌能够更有效的脱除水体中 的氮素，达到净化水质的目的。
【附图说明】
[0037] 图1为维氏硝化杆菌Y3-2扫描电镜照片。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于实施 例的范围。
[0039] 本发明所述的维氏硝化杆菌Y3-2为发明人分离自湖泊沉积物，分属于维氏硝化 杆菌，拉丁文名NitrobacterWinogradskyi(CCTCCM:2014203)。
[0040] 实施例中的欧洲亚硝化单胞菌ATCC19718和施氏假单胞菌ATCC17588,购自上海 复祥生物科技有限公司。
[0041] 实施例中硝化细菌培养时间的确定，以nh4-n和no2-n的定性检测方法为准，从培 养开始，每天定性检测nh4-n和no2-n，至定性检测显示nh4-n和no2-n均完全消耗完为培养 结束，期间为半连续补料培养时间。
[0042] 实施例中反硝化细菌培养时间的确定，以Ν02-Ν和Ν03-Ν的定性检测方法为准，从 接种施氏假单胞菌开始，每天定性检测no2-n和no3-n，至定性检测显示no2-n和no3-n均完 全消耗完，期间为批次培养时间。
[0043] 实施例中两种硝化细菌的菌浓度均以Real-timePCR的方法进行测定，反硝化细 菌浓度以稀释涂平板的方法进行测定。
[0044] 欧洲亚硝化单胞菌ATCC19718单菌发酵，采用本发明的硝化细菌培养基，消耗等 量NH4-N的情况下，需要6天时间；维氏硝化杆菌Y3-2单菌发酵，消耗等量Ν02-Ν的情况下， 需要6天时间；而反硝化细菌ATCC17588单独发酵，需要本发明的营养液，并额外添加ΚΝ03， 需要发酵2天才可以达到本发明所得混合菌剂中ATCC17588的浓度，3种菌剂单独发酵总时 长为14天。
[0045] 实施例1 :
[0046] 一种维氏硝化杆菌Y3-2,通过以下方式得到：
[0047] 该菌株是发明人于2008年在武汉市龙王庙污水处理厂活性污泥中富集、分离、纯 化得到。该菌株已于2014年5月14日，送往中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：维 氏硝化杆菌（NitrobacterWinogradskyi)Y3_2,保藏编号：CCTCCN0:M2014203,地址：武 汉武汉大学。
[0048] 该菌剂单独培养的方法，采用硝化细菌培养基进行培养，pH8. 0-8. 5,温度30°C， 接种量 10%