一种化合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从车前草中分离得到的一种新的化合物，及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 车前草为车前科Plantaginaceae植物车前PlantagoasiaticaL.或平车前 PlantagodepressaWilld.的干燥全草，是《中国药典》（2010年版）收载的常用中药。目 前，已发现的车前科有3属，约200种，分布遍及全世界。我国仅产车前属Plantago,约13 种。除车前与平车前外，国内外研究较多车前草还有大车前PlantagomajorL.。车前草 性味甘寒，具有利水、清热、明目、祛痰的功效。主治淋病、尿血、小便不通、黄疽、水肿、热痢、 泄泻、目赤肿痛、喉痛等。《草性论》载"治尿血，能补五脏，明目，利小晒干的车前草便，通五 淋"。《本草逢原》载"若虚滑精气不固者禁用"。性味和功用甘，寒，归手太阳，阳明经。利 7K，清热，明目，祛痰，用于小便不通，淋池，带下，尿血，黄疸，水肿，热痢泄泻，鼻紐，目赤肿 痛，喉痛，咳嗽，皮肤溃疡。
[0003] 讫今为止，已从前述3种车前草中分离和鉴定出超过60种化合物，按其主要结构 类型可分为环烯醚萜类、黄酮类、苯乙基苷类、酚酸类和脂肪酸类等成分。环烯醚萜类有利 尿，抑菌，抗四氧化碳引起的肝中毒，利胆作用；黄酮类可作用于呼吸中枢，缓解呼吸运动而 镇咳，兴奋分泌神经使气管及支气管分泌增加而祛痰；苯乙基苷类有消炎、抑菌、抑制Camp 磷酸二酯酶和醛糖还原酶的活性；酚酸类具有杀菌、升白、利胆、抑制血小板聚集等功能。
[0004] 现代药理学研究表明，车前草具有多种药理活性，用途广泛，可以用于治疗慢性支 气管炎、急性黄疸型肝炎、痛风性关节炎、高血压、细菌性痢疾、隐匿性肾炎、青光眼和痛风 等。
[0005] PC12细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤，具有神经元的特征，因此作为神经元的模型用 于研究神经元细胞的死亡方式及机制的研究。多项研究已经表明，Αβ对PC12细胞的细胞 毒性作用是由于氧应激、线粒体功能异常等引致细胞凋亡。
【发明内容】
[0006] 本发明的发明目的是提供一种从车前干燥全草中分离得到的一种新化合物，该化 合物可以作为制备保护神经药物中的有效成分。
[0007] 本发明的上述发明目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0008] 一种化合物，它的结构如（I):
[0009]
[0010] -种上述化合物的制备方法，包含以下操作步骤：
[0011] a、车前草粉碎，用85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油 醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物；
[0012] b、步骤a中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，依次用20%乙醇和80%乙醇洗脱， 收集80 %乙醇洗脱液，减压浓缩得80 %乙醇洗脱物浸膏；
[0013] c、步骤b中80 %乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1、60:1、 30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；
[0014] d、步骤c中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
[0015] e、步骤d中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为65% 的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-11个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物 (I);
[0016] 上述步骤中所述的85%乙醇、20%乙醇和80%乙醇均是指体积百分浓度。
[0017] 作为优选，所述步骤a中的车前草是车前草的干燥全草
[0018] 进一步的，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0019] 本发明的化合物是从车前干燥全草中首次分离出来的化合物，该化合物具有如下 有益效果：
[0020] 应用20ymol/LΑβ25 35能有效建立体外培养的大鼠嗜铬瘤细胞株PC12凋亡模 型，利用本发明的化合物（I)进行对照试验，证明本发明的化合物（I)能部分对抗 Αβ25 35诱导的PC12凋亡，证明其在制备保护神经药物中具有有效的药用价值，可以用来开 发成保护神经的药物。并且本发明的化合物或该化合物制备的药物可通过口服或注射的形 式施用于需要治疗的患者。
【附图说明】
[0021] 图1为化合物（I)结构式；
[0022] 图2为化合物（I)二维1H」HCOSY谱；
[0023] 图3为MTT代谢率检测Αβ25 35对PC12细胞的毒性作用；
[0024] 图4为Αβ25 35对PC12细胞LDH释放率的影响；
[0025] 图5为Αβ25 35和/或化合物（I)对PC12细胞LDH释放率的影口向。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0027] 主要材料、试剂来源：
[0028] 乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限 公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0029] Αβ25 35购于美国sigma公司。MTT(四唑氮蓝）购于美国Amresco公司。LDH测定 试剂盒购于南京建成生物有限公司。吖啶橙（A0)购于美国sigma公司。溴化乙啶（EB)购 于美国sigma公司。RNase酶购于美国sigma公司。蛋白酶K购于美国sigmaAnnexin公 司。V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。D-MEM/F12培养 基干粉购于美国GibcoL公司。马血清购于美国hycLon公司。胎牛血清购于杭州四季青生 物工程有限公司。多聚赖氨酸（PLL)购于美国sigma公司。化合物（I)自制，HPLC归一 化纯度大于98%。
[0030] 仪器类型：低温高速离心机，美国Heraeus;二氧化碳培养箱，美国SHELL/JB;超 净工作台，苏州净化设备厂；雷勃MK3酶标仪，芬兰Thermolabsystems;焚光显微镜，德国 Leica;流式细胞仪EpicsXL，美国CouLter公司；电泳系统，北京六一仪器厂；雷勃MK3酶标 仪，芬兰Thermolabsystems;焚光显微镜，德国Leica;流式细胞仪EpicsXL，美国CouLter 公司。
[0031] 实施例1 :化合物（I)分离制备及结构确证
[0032] (a)车前的干燥全草（8kg)粉碎，用85%乙醇热回流提取（25LX3次），合并提取 液，浓缩至无醇味（6L)，依次用石油醚（6LX3次）、乙酸乙酯（6LX3次）和水饱和的正丁 醇（6LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（333g)和正丁醇萃取物；(b) 步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，依次用20%乙醇（8L)和80% (12L) 乙醇洗脱，收集80 %乙醇洗脱液，减压浓缩得80 %乙醇洗脱物浸膏（152g) ;(c)步骤（b) 中80%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1 (7个柱体积）、60:1 (7个柱体 积）、30:1(8个柱体积）、15:1(7个柱体积）和1:1 (5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4(38g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为 20:1 (10个柱体积）、12:1 (8个柱体积）和5:U6个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得 到3个组分；（e)步骤（d)中组分2 (llg)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百 分浓度为65 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-11个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯 的化合物（I) (26mg)。
[0033] 结构确证：
[0034] 无色粉末；HR-ES頂S显示[M+Na]+为m/z493. 2604,结合核磁特征可得分子式为 C28H3S06,不饱和度为 10。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMS0-d6, 500MHz) :Η-2(2· 99,dd，J= 18. 8, 3· 3)，H-2 (2· 49,dd，J= 18. 8, 2· 2)，H-3 (4· 29,dd，J= 3· 3, 2· 2)，H-4 (3· 69,d，J= 9. 4)，H-6(3. 37，d，J= 3. 2)，H-7(2. 14，dt，J= 14. 6,3. 5)，H-7(1. 29，dd，J= 14. 6,11. 3)， H-8 (1. 62,m)，H-9 (1. 90,m)，H-ll(1. 18,m)，H-ll(0· 94,dd，J= 13. 2,4. 0)，H-12 (1. 88,m)， Η-12 (1· 22,m)，Η-14 (1· 05,m)，Η-15 (1· 64,m)，Η-15 (1· 17,m)，Η-16 (1· 68,m)，Η-16 (1· 36，m)，H-17 (1. 12,m)，H-18 (0· 66,s)，H-19 (4. 19,d，J= 9. 0)，H-19 (3. 86,d，J= 9. 0)， H-20 (1. 98,m)，H-21 (0· 97,d，J= 6. 7)，H-22 (4. 35,dt，J= 13. 3, 3. 5)，H-23 (2. 42,brdd， J= 17. 0,13. 3)，H-23(1. 92，m)，H-27(1. 88，s)，H-28(1. 94，s)，6-0H(3. 16，d，J= 9. 4);核 磁共振碳谱数据Sc (ppm，DMS0-d6,125Hz) :208. 0 (C，1-C)，42. 8 (CH2, 2-C)，74. 3 (CH，3-C)， 69. 7 (CH，4-C)，60. 8 (C，5-C)，56. 9 (CH，6-C)，29. 8 (CH2, 7-C)，28. 8 (CH，8-C)，36. 9 (CH， 9-C)，50. 1 (C，10-C)，22. 1 (CH2,11-C)，39. 3(CH2,12-C)，43. 2(C，13-C)，54. 8(CH，14-C)， 24. 2(CH2, 15-C)，27. 3(CH2, 16-C)，52. 3(CH，17-C)，11. 8(CH3, 18-C)，63. 5(CH2, 19-C)， 38. 9 (CH，20-C)，13. 5 (CH3, 21-C)，78. 4 (CH，22-C)，29. 7 (CH2, 23-C)，149. 1 (C，24-C)， 122. 1 (C，25-C)，167. 2 (C，26-C)，12. 6 (CH3, 27-C)，20. 7 (CH3, 28-C);碳原子标记见图 1。 4-?COSY谱（图2)表明化合物（I)含有-CH2CH(0R)-部分结构[δΗ2· 99(dd，J= 18. 8,3· 3Hz，Η-2β)，2· 49(dd