由间充质干细胞生产诱导性多能干细胞的方法以及由该方法生产的诱导性多能干细胞的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于从间充质干细胞诱导出多能干细胞的培养基组合物以及使用该培养基组合物生产诱导性多能干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]干细胞是用于分化阶段前的未分化细胞的通用术语，干细胞可从多种组织中获得。干细胞具有能够在一定量的时间中连续生产与其本身相同的处于未分化状态的细胞的特性，并具有能够在适当的条件下分化为构成生物组织的各种细胞的特性。
[0003]根据分化能力和生成阶段，干细胞可大体上分为胚胎干细胞和成体干细胞。按照视干细胞分化能力而定的另一分类，干细胞可分为多能(pluripotency)干细胞、多潜能(multipotency)干细胞和单能(unipotency)干细胞。
[0004]成体干细胞可分为多潜能干细胞或单能干细胞。作为代表性的成体干细胞，存在间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)。已知间充质干细胞分化成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和神经元，造血干细胞主要分化成血液中的血细胞，例如红血球、白血球或血小板。
[0005]同时，多能干细胞是指具有多种分化能力的干细胞，该多能干细胞能够分化成构成机体的所有三种胚层(germ layer)，由此能够分化成人体的各种细胞或器官组织。通常，胚胎干细胞与此相符。人胚胎干细胞引发了许多伦理问题，因为它们是由能够发育成人的胚胎产生。然而，已知胚胎干细胞相比成体干细胞而言具有优异的细胞增殖和分化能力。成体干细胞引起较少的伦理问题，因为它们可从骨髓、血液、脑、皮肤等中获得。然而，相比于胚胎干细胞而言，成体干细胞具有有限的分化能力。
[0006]作为用于克服这些问题的解决方案，已尝试了多种技术，以通过使来源于成体干细胞的细胞去分化来生产与胚胎干细胞类似的定制的多能干细胞。代表性的技术包括与ES细胞融合、体细胞核转移、通过基因因子进行的重编程(reprogramming by gene factor)等。根据与ES细胞融合，诱导的细胞具有另外两对基因，这将导致细胞稳定性方面的问题。体细胞核转移需要大量卵细胞，并且效率非常低(这些都是缺点)。通过基因因子进行的重编程是使用病毒(包括癌基因)通过插入特定基因来诱导去分化的技术，而这一技术具有高的癌症发生风险，并且由于方法方面的低效和困难度，在开发细胞治疗产品的可能性方面不利。
[0007]为了成功且大量地获得多能干细胞，在培养分离的脐带来源的单核细胞的阶段中的培养基组合物非常重要。因此，需要关于以更高效的诱导方法制备更多量的多能干细胞的研究。
[0008]上述【背景技术】中所提供的事项仅意在帮助更好地理解本发明的背景。然而，不应该被解释为本发明落入了本领域技术人员已知晓的相关技术。
【发明内容】
[0009]技术问题
[0010]本发明人尝试寻找以高效率诱导出多能干细胞的方法，以用于开发在实践中具有高的安全性和生产效率的细胞治疗产品。结果，本发明人发现当将腔昆布(Ecklonia cava)提取物(安全的天然提取物)加入到细胞培养基中时，能够使用间充质干细胞安全且高效地生产诱导性多能干细胞，从而完成了本发明。
[0011]就此而言，本发明的目的是提供用于使间充质干细胞去分化成为诱导性多能干细胞的培养基组合物，该培养基组合物含有腔昆布提取物。
[0012]本发明的另一目的是提供用于生产诱导性多能干细胞的方法，该方法包括在含有腔昆布提取物的培养基中，使间充质干细胞去分化成为诱导性多能干细胞。
[0013]本发明的又一目的是提供通过上述方法生产的诱导性多能干细胞。
[0014]本发明的又一目的是提供用于细胞治疗的组合物，该组合物包含诱导性多能干细胞。
[0015]通过本发明的以下详细描述、权利要求书和附图，可更清楚地理解本发明的其它目的和优势。
[0016]技术方案
[0017]根据本发明的实施方式，提供了用于使间充质干细胞去分化成为诱导性多能干细胞的培养基组合物，该培养基组合物含有腔昆布提取物。
[0018]本发明人尝试寻找高效地诱导出多能干细胞的方法，以用于开发在实践中具有高的安全性和生产效率的细胞治疗产品，而不会产生关于破坏胚胎的伦理问题。结果，本发明人发现当将腔昆布提取物(安全的天然提取物)加入到细胞培养培养基中时，能够以出乎预料的高效率生产诱导性多能干细胞。
[0019]腔昆布(作为包含在本发明的培养基组合物中的活性成分)是多年生褐色海藻，属于昆布目(Laminariales)巨藻科(Lessoniaceae)，主要存在于韩国Jeju-do和Ulleung-do的远洋、南部海岸，主要用于饲喂鲍鱼、海螺等，并且被用作制备海藻酸、碘或钾的主要原料，或者被用作食品。
[0020]本发明中使用的腔昆布提取物可使用水或有机溶剂进行提取，所述有机溶剂例如(a)无水或含水的具有1-4个碳原子的低级醇(甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、异丙醇和正丁醇等);(b)低级醇与水的混合溶剂；(c)丙酮；⑷乙酸乙酯；(e)氯仿；(f) 1，3- 丁二醇；(g)己烷；(h)乙醚等，优选甲醇或乙醇与水的混合溶剂。在使用混合溶剂进行提取的情况中，优选以50v/v% _8(^八％的量包含甲醇或乙醇。
[0021]近来，将腔昆布提取物应用到皮肤组合物(例如化妆品)的情况增多(参见韩国专利申请公开Nos.2013-0017159、2012-0040488、2010-0097293等)。然而，不存在将腔昆布提取物开发成用于诱导出多能干细胞的培养基的情况。
[0022]本文所用的术语“胚胎干细胞”是指从囊胚(受精后的早期发育阶段)的内细胞团中分离和培养的具有多能性的细胞。本文所用的术语“多能干细胞”是指具有多能性的干细胞，该干细胞能够分化为构成机体的所有三种胚层，即，内胚层、中胚层和外胚层。
[0023]本文所用的术语“分化(differentiat1n) ”是指在细胞生长期间通过分裂和增殖使细胞在结构或功能方面变得更特化的过程，即，活体的细胞、组织等在形状或功能方面发生改变以履行给定任务的过程。
[0024]本文所用的术语“细胞治疗产品”是用于以通过分离、培养和具体操作从人中制备的细胞和组织进行治疗、诊断和预防的药品，是指用于通过一系列动作(例如，通过体外增殖或选择同种异体细胞或异种细胞或者通过其它方式改变细胞的生物学性质)进行治疗、诊断和预防以恢复细胞或组织的功能的药品。根据细胞的分化程度，将细胞治疗产品大体上分为体细胞治疗产品和干细胞治疗产品。本发明特别涉及干细胞治疗产品。
[0025]本发明的间充质干细胞是分离自如下干细胞的细胞:来源于哺乳动物的胚胎干细胞或成体干细胞、优选脐带来源的间充质干细胞、更优选人脐带来源的间充质干细胞。干细胞可通过收集人体中的连接胎儿和胎盘的脐带来获得。来自脐带的间充质干细胞可使用多种方法进行收集。例如，含有单核细胞的溶液可通过以下方式获得:从人体中收集脐带，用DPBS洗涤所收集的脐带直到血液不再出现，用手术刀片切割经洗涤的脐带，并使其接受在37°C下进行的孵育。
[0026]本文所用的术语“培养基”是指用于细胞(例如干细胞等)的体外(in vitro)培养或分化的混合物，培养基含有细胞生长和增殖所必需的元素，例如糖、氨基酸、各种营养素、血清、生长因子、矿物质等。
[0027]本领域中的多种培养基已市售，并且可人工生产待使用的培养基。市售的培养基可包括:Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、Eagle基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、DMEM F-12、α -最小必需培养基(a -MEM)、Glasgow最小必需培养基(G-MEM)、Iscove改良的Dulbec