具核梭杆菌的恒温检测方法及其专用引物与试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其设及细菌的分子生物学检测方法，特别是设及具 核梭杆菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。
【背景技术】
[0002] 具核梭杆菌（F.nucleatum)属于革兰阴性专性厌氧菌，参与牙周疾病的炎症反 应，常在銀下菌斑中分离到，是在牙周病中起主导作用的微生物，也是成人牙周炎和青少年 牙周炎的可疑致病菌之一。该菌除可引起口腔疾病外，还可引起身体其他部位的感染，包括 脑、肺和肝，血液和关节，胸和腹部。具核梭杆菌还是一种常见的宫内感染厌氧菌，可在早产 且留有完整胎膜的孕妇羊水中检测出，提示其可能在早产发病机制中起了重要的作用。具 核梭杆菌作为主要的厌氧微生物在銀下菌斑中聚居，其存在与繁殖引起了牙周组织中局部 炎症的发生。
[000引 2011年10月，来自加拿大BC癌症研究所和化oad研究所的两个研究小组，证实运 种细菌也存在于肠道中，且其在肠道中的丰度与结直肠癌相关。现在，两项新研究提供了功 能证据，可帮助解释具核梭杆菌是如何推动癌症形成的。
[0004] 在发表于2013年8月13日《Cell化st&Microbe》杂志上的两篇论文中，分别由 哈佛医学院AleksandarKostic和凯斯西储大学MaraRoxanaRubinstein领导的研究小 组利用肠肿瘤形成小鼠模型和人类结肠癌细胞，证实具核梭杆菌诱导了促炎症反应和致癌 活动，促进了结直肠癌生长。
[0005] 环介导的等溫核酸扩增技术（LAMP)是由T.Notomi(NotomiT，Okayama Η,MasubuchiH，etal.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcids Res2000 :28(12) :63.)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和 一种具有链置换特性的dm聚合酶，在等溫条件下可W高效、快速、高特异地扩增祀序列。 近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。MasakiImai等人（ImaiM,Ninomiya A,MinekawaH,etal.RapiddiagnosisofHSNlavianinfluenzavirusinfection bynewlydevelopedinfluenzaHShemagglutiningene-specificloop-mediated isothermalamplificationmethod.JVirolMethods. 2007 ;141 (2):173-80.)利用 LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuy址i化yashi等人化ayashiN,Arai R,TadaS,TaguchiH,OgawaY.DetectionandidentificationofBrettanomyces/ Dekkerasp.yeastswithaloop-mediatedisothermalamplificationmethod.Food Microbiol. 2007 :24(7-8) :778-85.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引 物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可W检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出血 性败血病（V服)、巨细胞病毒（CMV)、埃博拉病毒巧B0V)、慢性伯基特淋己瘤病毒巧BV)、虹 彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒（工HHNV)、番茄斑萎病毒和番茄黄化曲叶病 毒等。但是迄今为止，市场上还未见用于检测具核梭杆菌的LAMP专用引物与试剂盒问世。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供用于检测具核梭杆菌的环介导等溫扩增成套引物。
[0007] 本发明提供的用于检测具核梭杆菌的环介导等溫扩增成套引物，其由引物1、引物 2、引物3、引物4和引物5组成；
[000引所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5的核巧酸序列分别 为序列表中的序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
[0009] 上述引物中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5的摩尔 比为 1 :1:8:8:4。
[0010] 本发明的另一个目的是提供用于检测具核梭杆菌的环介导等溫扩增试剂。
[0011] 本发明提供的环介导等溫扩增试剂，包括上述引物。
[001引上述试剂中，所述环介导等溫扩增试剂由DNA聚合酶、Tris·肥1、KC1、（畑4)2SO4、Tween20、甜菜碱、Mg2\dNTPs、上述的引物和水组成；
[0013] 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5在所述环介导等溫 扩增试剂中的浓度分别为 5pmol/ul、5pmol/ul、40pmol/ul、40pmol/ul和 20pmol/ul。
[0014] 本发明第Ξ个目的是提供用于检测具核梭杆菌的环介导等溫扩增试剂盒。
[0015] 本发明提供的试剂盒，其包括上述的引物或上述的环介导等溫扩增试剂。
[0016] 为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为具核 梭杆菌的DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系（如双蒸水）。
[0017] 具体的，该具核梭杆菌的LAMP检测试剂盒包括：20mMTris·肥1 (抑8. 8)，lOmM KCl，10mM(NH4)2S〇4,〇.l%Tween20,0.8M甜菜碱（betaine)，8mMΜ拆〇4，1.4mMdNTPeach, 8UBstDNApolymerase，40pmolFIP和BIP，20pmolLF，5pmolF3 和B3,抑指示齐IJ，具核 梭杆菌的基因组DNA(25μ1LAMP反应体系中使用2μ1)和双蒸水。
[0018] 如下a)或b)的应用也是本发明保护的范围：
[0019]a)上述的引物在制备上述试剂盒中的应用；
[0020] b)上述引物，或上述试剂，或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否 含有具核梭杆菌的产品中的应用；
[0021]C)上述引物，或上述试剂，或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测菌是否为具 核梭杆菌的产品中的应用。
[0022] 本发明第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测菌是否为具核梭杆菌的方法。
[0023] 本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述引物对所述待测菌进行LAMP反应，检 测LAMP反应产物确定待测菌是否为具核梭杆菌。
[0024] 上述方法中，所述LAMP反应的溫度为63 °C。
[00巧]上述方法中，所述检测LAMP反应产物确定待测菌是否为具核梭杆菌的方法为：若 能实现扩增，则所述待测菌为或候选为具核梭杆菌；若不能实现扩增，则所述待测菌不为或 候选不为具核梭杆菌。
[0026] 所述检测LAMP反应产物确定待测菌是否为具核梭杆菌的方法具体为1)或2):
[0027] 1)、浊度仪检测所述待测菌LAMP反应产物浊度变化曲线，若所述待测菌LAMP反应 产物浊度变化曲线呈上升状态，则所述待测菌为或候选为具核梭杆菌，若所述待测菌LAMP 反应产物浊度变化曲线不呈上升状态，则所述待测菌不为或候选不为具核梭杆菌；
[0028] 2)在所述LAMP反应中添加巧黄绿素与氯化儘混合液，检测所述待测菌LAMP反应 产物的颜色，若所述待测菌LAMP反应产物为绿色，则所述待测菌为或候选为具核梭杆菌， 若所述待测菌LAMP反应产物不为绿色，则所述待测菌不为或候选不为具核梭杆菌。
[002引上述方法中，所述LAMP反应的模板为待测菌的基因组DNA。
[0030] 采用W上方案，本发明具有W下优点：
[0031] 1)高特异性：5条引物对具核梭杆菌祀序列的7个特异区域的识别保证了LAMP扩 增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核巧酸的基因标本中找出相应的祀序列进行扩 增；
[003引。高灵敏度：灵敏度比普通PCR方法高10倍；
[0033] 3)结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果（抑显色），也可W直接用浊度仪判断结 果；
[0034] 4)操作简单：只要将检测样品（祀核酸）和检测试剂一起放入60-65°C恒溫水浴 锅中50分钟后就可W判断结果；
[0035] 5)快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，且产率可达到0.5mg/ mLo
[0036] 综上所述，本发明可W在等溫条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到具 核梭杆菌，不需要复杂仪器，为具核梭杆菌的检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫 生单位和各疾病预防控制中屯、筛查和检测具核梭杆菌，具有广阔的市场前景和较大的经 济、社会效益，适于大范围推广应用。
[0037] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0038] 图1为本发明具核梭杆菌LAMP检测方法最佳引物的浊度仪结果。
[0039] 图2为本发明具核梭杆菌LAMP检测方法最佳溫度的浊度仪结果。
[0040] 图3为本发明具核梭杆菌LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果。
[0041]图4为本发明具核梭杆菌LAMP检测方法特异性的抑染色检测结果。
[0042] 图5为本发明具核梭杆菌的LAMP检测方法对具核梭杆菌灵敏度的浊度仪检测结 果