Rrm1基因表达量荧光定量pcr检测试剂盒及其应用
【专利说明】RRM1基因表达量黄光定量PCR检测试剂盒及其应用 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种人RRM1基因巧光定量PCR检测试剂盒及其应用。 (二）【背景技术】
[0002] 核糖核巧酸还原酶（ribonucleotidere化ctase，RR)是DNA合成通路中的限速 酶，它能逆转二憐酸核巧酸为二憐酸脱氧核巧酸，后者是DNA合成和修复必不可少的底物。 RR包括2个亚单位：Ml和M2。M2亚单位携带接触抑制区，控制底物转化；Ml亚单位（RRM1) 控制底物的特异性和整个酶的活生。RRMlmRNA有19个外显子，其编码的蛋白质含有792 个氨基酸，分子量为85kDa，由一个活性位点与Ξ个相互独立的变构位点构成。RRM1基因 定位于染色体llql5. 5区域着丝粒部分，该区域常出现恶性肿瘤的杂合子缺失（lossof heterozygosity,LOH)，被称为LOHllA，与恶性肿瘤的侵袭、转移关系密切。研究已发现多 种恶性肿瘤（如乳腺癌、胃癌和食管癌等）存在llql5. 5的杂合性缺失。在对非小细胞肺 癌（NSCLC)的研究中发现，有75%的患者存在运种杂合性缺失，其中88%的非小细胞肺癌、 57%的鱗癌和40%的腺癌存在运种杂合性缺失。
[0003] 通过对小鼠的纤维母细胞进行研究发现，RRM1可W抑制纤维母细胞的侵袭及 转移，是一种具有肿瘤抑制功能的基因，其抑癌功能主要是通过诱导位于10号染色体 的同源丢失性憐酸酶一张力蛋白基因（phosphataseandtensionhomologydeleted onc虹omosometen,PTEN)的转录及表达水平和降低局部粘着斑激酶（focala化esion kinase,FAK)的憐酸化水平来发挥。同时，也可W通过诱导脱氧核巧酸和憐酸酶来控制细胞 增殖，阻止细胞发生迁移、浸润和转移。当邸(XI，RRM1等修复基因切除DNA链中的受损部 分后，RRM1不但可W给DNA连接酶提供脱氧核糖核巧酸来填补DNA链上留下空缺。此外， 它还可W借助RRM1/P53R2损伤修复途径来提高DNA的修复能力。
[0004] 在对RRM1转基因小鼠肺癌细胞系及结肠癌细胞系的研究中，发现RRM1可W诱导 细胞周期的改变而使其停滞于G2期，并参与细胞调亡及DNA的损伤及修复，且RRM1高表达 的小鼠对肿瘤的抑制作用比RRM1低表达的小鼠更强大。研究显示，非小细胞肺癌的癌组织 中RRM1阳性表达率明显高于癌旁组织，而且RRM1低表达（mRNA水平）患者的中位生存时间 比RRM1高表达（mRNA水平）患者的中位生存时间长（13. 9个月VS10. 9个月，P= 0. 039)， 而且RRM1蛋白阳性表达的患者的总体生存期明显短于阴性表达的患者巧.1个月vs12.9 个月，P=0.022)。分析发现RRM1的表达是肿瘤分期、体力状态和体重减轻之外的另一个 独立预测因素。因此，有人认为RRM1是生物学上和临床NSCLC恶性行为的重要决定因子， 可为临床决策增加一个重要的判断信息。 阳0化]吉西他滨（Gemcit油ine，Gem)是喀晚类抗代谢药物，主要作用于DNA合成期（S期），也可阻止G1期向S期进展，是细胞周期特异性药物。Gem是一种广谱的抗肿瘤药物， 对其他实体瘤包括乳腺癌、膜腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、间皮瘤、食管癌、胃癌和 大肠癌，W及肝癌、胆管癌、鼻咽癌、睾丸肿瘤、淋己瘤和头颈部癌等均有一定疗效。回顾性 检测40例经Gem方案治疗的晚期NSCLC患者标本的RRMlmRNA，中位生存对于低表达和高 表达者分别为12. 9和5. 1个月，P= 0. 022。RRMlmRNA低表达者明显受益于Gem方案的化 疗，推测RRM1有可能作为Gem相关药物的效应预测因子。通过建立活体内NSCLC模型检测 Gem耐药的原因，发现RRM1基因在耐药组高表达，并证实RRM1基因是导致Gem耐药的关键 祀点。此外，RRM1过表达的转基因小鼠修复DNA的速度比非转基因动物快。RRM1通过及 时有效地修复致癌物诱导的基因组的破坏，在肿瘤易感性方面扮演着关键的角色，影响Gem 方案的疗效。下调非小细胞肺癌细胞株肥3/GEM-R细胞（RRM1高表达）中的RRM1表达量， 可W逆转其对Gem的耐药；通过体外过表达RRM1，发现RRM1的表达上调3倍，吉西他滨J顿 销，卡销的IC50分别上升8倍，1. 2倍和1. 5倍，RRM1的表达下调则出现相反的趋势。一 项包含1243例晚期NS化C患者meta分析表明，RRM1低表达组对包含Gem方案的疗效明显 优于RRM1高表达组，总生存期和无疾病进展期分别比后者延长3. 94和2. 64个月。另一项 140例随机III期临床试验，采用自动化定量免疫巧光技术检测RRM1的表达水平，RRM1的 高表达组Gem疗效较差；反之，RRM1低表达则疗效较好，进而证明检测RRM1表达水平能预 测肿瘤化疗疗效，即Gem对RRM1低表达者疗效好，对RRM1高表达者差；是预测疗效和临床 预后的有价值指标。 (Ξ)
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种人RRM1基因巧光定量PCR检测试剂盒，用于检测人RRM1 基因的表达，特异性好，灵敏度高。 阳007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 一种检测人RRM1基因突变的巧光定量PCR试剂盒，主要包括特异性引物和PCR反 应试剂；所述特异性引物序列如下：
[0009] 上游引物：5 ' -CAAGGCTTGTACAGTGGGGT-3，
[0010] 下游引物：5 ' -CCATGGGAGAGTGTTTGCCA-3，。
[0011] 所述PCR反应试剂为本领域常规试剂，主要包括：dNTP、反转录缓冲液、PCR缓冲 液、Mg2\双蒸水、逆转录酶、Tag酶等，也可直接采用市售PCRMix成品。
[0012] 所述试剂盒还可包括人RRM1基因检测标准品，所述标准品序列如下：
[0013] 5^-CAAGGCTTGTACAGTGGGGTCACCACAGTGGAACTAGATACTTTGGCTGCTGAAACAGCTGCAA CCTTGACTACTAAGCACCCTGACTATGCTATCCTGGCAGCCAGGATCGCTGTCTCTAACTTGCACAAAGAAACAA AGAAAGTGTTCAGTGATGTGATGGAAGACCTCTATAACTACATAAATCCACATAATGGCAAACACTCTCCCATGGT GG-3'。
[0014] t不准品的制备：WGenebank中发布的人RRM1的基因序列为柄；准，W健康体