一种添加人工合成的前体物制备吡咯喹啉醌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物化工领域，具体设及一种利用菌体细胞破碎上清液并加入PQQ前 体物一-人工合成多肤，从而在体外合成化咯哇嘟酿的方法。
【背景技术】
[0002] 化咯哇嘟酿（Pyrroloquinolinequinine，PQ曲是一种水溶性酿类化合物，是葡萄 糖脱氨酶和乙醇脱氨酶的辅酶，被认为是新的B族维生素（化化re2003 ;422:832)。PQQ分 子量为330,最早是在微生物中发现，随后研究表明其也存在于动植物体内，结构式如下式 所示
[0003]
[0004] 业已证明PQQ具有重要的生理功能，比如维持皮肤健康、刺激神经生长因子、增强 免疫功能、促进细胞生长、抗氧化、清除自由基、增强细菌对极端环境条件的耐受性W及参 与细胞信号传导等。在医药领域，PQQ具有防治肝损伤、保护神经组织、刺激能量生成、强化 免疫等生理功能。因此，可W用于治疗帕金森综合症、老年痴呆、屯、脏病、肝硬化等。在畜禽 养殖业中，PQQ作为一种新型类维生素物质，可促进机体生长、提高繁殖、抗氧化、抗应激和 增强免疫，比如在饲料中添加适量PQQ可W在一定程度上提高蛋鸡产蛋率和鸡蛋品质，并 能显著提高蛋鸡的抗氧化能力。由于其独特的理化性质和多样的生理功能，可用于食品、医 药、农业、工业等领域，具有广泛的开发应用前景。
[0005] PQQ早期生产W化学合成方法为主，但合成步骤多，产率低，异构体和副产品的 去除需要多步纯化，并需用多种有毒试剂而污染环境（JACS，1981 ;103 :5599-2600)。因 此，一般认为生物学合成方法更具产业化意义。迄今为止，PQQ主要发现于革兰阴性菌中， 比如甲基杆菌属（Methylobacterium)、葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter)、假单胞菌属 (Pseudomonas)等。不同菌种PQQ合成量有所不同，有些菌种产生痕量PQQ供生理代谢需 求，还有些菌却能产生过量PQQ，并且分泌到胞外。目前，有采用微生物发酵的方法生产PQQ 的报道，但是PQQ产量很低，仅有0.〇7-7mg/L。因此，需要开发新的技术，大量生产PQQ，从 而满足生产需求。
[0006] 体外合成技术是一种新型的生物合成技术，具有底物转化控制性好、连续性强并 且耐受性强。与传统发酵技术相比，可W有效克服目标产物对合成反应的限速效应，从而大 大提高产品的产量。目前，该技术已经用于一些化工产品的生产中。例如，Waleed Ahmad 化attak等报道了利用无细胞体系技术生产乙醇的技术。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种添加人工合成的前体物制备化咯哇嘟酿的方法，该方法 条件简单，过程快捷，便于大规模工业化生产。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用W下技术方案：
[0009] -种添加人工合成的前体物制备化咯哇嘟酿的方法，包括如下步骤：
[0010] (1)将化咯哇嘟酿产生菌按照5%的比例接入发酵培养基中，在28°C下震荡培养 3d，获得菌悬液；
[0011] (2)菌悬液经高速离屯、，获得菌体，用缓冲液将菌体悬浮，然后用超声法破碎，经高 速离屯、，取上清液；
[0012] (3)将人工合成的前体物加入到上清液中，在35-50°C恒溫条件下反应12-2化。 [001引 所述步骤（1)中所述化咯哇嘟酿产生菌为Methylobacterium extorquens?KlebsiellaPneumonia，Gluconobacteroxidans，Pseudomonas aeruginosa,Bradyrhizobiumsp.或Streptomycesrochei。
[0014]所述步骤似中的缓冲液为憐酸缓冲液或巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液，缓冲液的抑 为 4. 5-7. 5。
[0015] 所述步骤（3)中人工合成的前体物为一段多肤，其序列特征如SEQIDNo. 1、SEQ IDNo. 2、SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 4、SEQIDNo. 5 或沈QIDNo.6所示。
[0016] 所述步骤（3)中所加人工合成的前体物浓度为l-30mmol/L。
[0017] 本发明的有益效果：本发明利用菌体细胞破碎上清液并加入PQQ前体物一一人工 合成多肤，从而在体外合成化咯哇嘟酿（PQQ)，转化率可达70-80 %，PQQ产量可达600mg/l， 而且利用上述方法，条件简单，过程快捷，便于大规模工业化生产，对促进PQQ的产业化具 有重要意义。
【附图说明】
[001引 图1为PQQ标准品在SMR模式下m/z为285的特征碎片离子峰色谱图；
[0019] 图2为反应产物在SMR模式下m/z为285的特征碎片离子峰色谱图；
[0020] 图3为目标产物峰的紫外光谱，其中，A为标准品，B为实施例1制得的样品； [002。 图4为目标产物峰的质谱图，其中，A为标准品，B为实施例1制得的样品。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] 本实施例"添加人工合成的前体物制备化咯哇嘟酿"的方法，步骤如下：
[0024] (1)氧化葡萄糖酸杆菌发酵：将菌种按照5%的比例接入发酵培养基（每升含有 40g山梨醇、20g酵母提取物、5g(NH4)2S〇4、2gKH2P〇4、5gΜ拆〇4巧2〇)中，在28°C下震荡培养 3d。发酵罐培养时按照10%接种，培养基浓度为正常2倍。将菌种接种至富集培养基，28Γ 下震荡培养5d。
[00巧](2)生物合成体系建立：菌悬液经高速离屯、，获得菌体，用抑为6. 5的憐酸缓冲液 将菌体悬浮，然后用超声法破碎，经高速离屯、，取上清液；
[0026] (3)生物合成化咯哇嘟酿：在上清液中加入30mmol/L的人工合成的多肤SEQID No. 1，在35°C的恒溫磁力揽拌反应器中反应12小时。产物分析
[0027] 4. 1产物的LC-MS检测
[002引采用LC-MS/MS法检测反应体系中的目标产物。其中，分析条件控制如下：
[0029]A)液相色谱分析条件
[0030] 色谱柱：0DS柱
[0031] 流动相：乙腊-水（含0. 1-0. 2 %甲酸）
[003引梯度洗脱：0-10min，流动相中乙腊体积浓度为30% -90%
[0033]流速：100-200μL/min
[0034]柱溫：20-26°C
[003引B)质谱分析条件
[0036] 离子源：ESI 脱溶解溫度
[0037] 扫描方式：阴离子 干燥气流速：5-7L/min
[0038] 銷气溫度：350-410°C 毛细管电压：2500-3200v
[0039] 銷气流速：500-600L/h碰撞能量：10-35V
[0040] 锥孔电压：2. 5-3. 5V 质量扫描范围：100-1700m/z，每0. 2s采集1次图谱。
[0041] 通过对反应液进行LC-MS/MS法分析，结果表明，反应产物中含有PQQ。通过与PQQ 标准品质谱数据对比，结果表明，样品与其完全一致。
[004引实施例2
[0043] 本实施例的添加人工合成的前体物制备化咯哇嘟酿的方法，步骤如下：
[0044] (1)扭脱甲基杆菌（Meth}dobacte;riumextorquensAM1)发酵：将菌种按照 5% 的 比例接入发酵培养基（每升含有3旨(畑4)2册〇4 2g、K2HP〇4、lg化ClUOugFeS〇4'7H2〇、0. 2g ]\^5〇4·Η2〇、Μη504·4Η2〇、??3Π?;?ηθ10^、Κ;??3〇??3ν;?η20ug、Calciumpanto化enate20ug、 Pyridoxine·HC120ug、Biotinlug、p-aminobenzoicacidlOug、Nicotinicacid20ug) 中，在28Γ下震荡培养3d。发酵罐培养时按照10%接种，培养基浓度为正常2倍。将菌种 接种至富集培养基，28°C下震荡培养5d