一种使用家蚕制备镇痛多肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种使用家蚕制备镇痛活性多肽的方法，属于基因工程领域。
【背景技术】
[0002]芋螺毒素是由海洋软体动物芋螺iConus)分泌的一类用于自卫和捕食的活性肽类毒素。芋螺毒素分子质量小，通常由10-30个氨基酸残基组成，大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。芋螺毒素种类繁多，可达5万种以上，其一级结构多变，但信号肽及前导肽序列保守。根据保守的信号肽序列，芋螺毒素可分为^、1、0、1、？、S、T等超家族(superfamily)，再依据家族中毒素的半胱氨酸骨架，结合其药理活性，又可分为α、μ、ω、δ、Ψ、σ、λ、κ、γ等家族(family)。芋螺毒素能特异性地作用于体内多种(钾、钠、钙等)离子通道、细胞膜上的各种神经递质和激素的受体，从而干扰细胞或神经中的信号传递。因此，在治疗慢性疼痛、急性疼痛、癫痫、神经保护、心血管疾病、精神失常、运动失调、痉挛症、癌症及中风等方面具有广泛的应用前景。如0-超家族中的ω-芋螺毒素可直接作用于钙离子通道，阻断痛觉传递，并具有镇痛效应。由于芋螺毒素在作为分子探针用于神经药理研究及作为新型药物前导物开发临床用新药方面具有极高的研究和利用价值。在芋螺毒素中，ω -MVI ΙΑ来源于海洋生物幻芋螺(Corns magus,也称僧袍芋螺)，能特异地阻断钙离子通道，阻止疼痛信号的传导，以其为有效成分的Ziconotide (商品名Prialt?)已被FDA批准用于治疗慢性疼痛(Terlau, Olivera.Conus venoms: a rich source of novel 1nchannel-targeted peptides.Phys1l Rev.2004， 84: 41_68)0
[0003]目前，芋螺毒素的获得主要是依赖于芋螺的天然毒液的提取。但是，由于芋螺中芋螺毒素含量低，且大量采集海洋生物也不利于保持生态平衡。因此，利用经典的生化提取的方法直接从芋螺中分离芋螺毒素已经难以满足研究和药物生产的需要，从而使芋螺毒素的深入研究及开发受到一定限制。许多科学家希望采用多肽固相合成的方法来解决这一困难，其技术路线是通过分离天然芋螺毒素后测序或采用基因克隆方式获得芋螺毒素序列，然后采用人工化学合成获得更多量的芋螺毒素。一些结构简单的芋螺毒素，如已经得到应用的ω-MVIIA，已可通过化学合成法来获得。但是人工合成芋螺毒素的成本很高，还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。因此，有科学家提出可将芋螺毒素的基因转化到大肠杆菌或酵母等微生物中表达，但芋螺毒素的氨基酸序列短，后期分离纯化比较困难，且翻译后修饰复杂，在微生物表达系统中无法解决C端酰胺化的问题，不能获得高活性的重组芋螺毒素(Zhan et al.A fus1n protein of conotoxin MVIIA and th1redoxinexpressed in Escherichia coli has significant analgesic activity.B1chemB1phys Res Commun.2003, 311: 495-500)。
[0004]家蚕杆状病毒表达系统是以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)为载体，家蚕为宿主的昆虫杆状病毒表达载体系统，其操作安全、表达水平高，能对重组蛋白进行糖基化、信号肽切除等翻译后加工，获得的重组蛋白具有比较完整的生物学功能。特别关键的是，研究发现家蚕抗菌肽CMIV具有C端酰胺化(屈贤铭，吴克佐，邱雪贞.经聚肌胞苷酸诱导家蚕蛹血淋巴中六种抗菌体的分离与鉴定.生物化学与生物物理学报.1986，18(3):284-291 )，说明家蚕中存在酰胺化途径，在家蚕中有望解决芋螺毒素ω-MVIIA的C端酰胺化的问题，从而获得高活性的重组ω-MVIIA。此外，家蚕杆状病毒表达系统也可用于开发家蚕生物反应器，成本低廉，易于产业化。
[0005]本发明利用基因工程技术，构建了携带芋螺毒素ω-MVIIA基因的重组BmNPV病毒，采用小鼠醋酸扭体试验证实，表达芋螺毒素ω-MVIIA的受感染家蚕的血液具有显著的镇痛活性。本发明为表达具有镇痛活性的芋螺毒素ω-MVIIA提供了新的方法，具有潜在的应用价值。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术中对基因工程表达芋螺毒素ω-MVIIA的不足而公开一种表达具有镇痛活性的重组芋螺毒素的制备方法及其应用。
[0007]本发明通过以下技术方案实现上述目的:
(1)根据BmNPV密码子使用频率优化芋螺毒素ω-MVIIA基因序列；
(2)合成优化后的ω-MVIIA基因，经BaiMl/HindVll双酶切后，连入经同样酶切的供体质粒pFastBacDual，并连入绿色荧光蛋白(EGFP)基因，构建重组供体质粒pFBD_MVIIA/EGFP ；
(3)采用Bac-to-Bac法，将重组供体质粒pFBD-MVIIA/EGFP上的ω-MVIIA基因和EGFP基因转座到BmNPV，通过蓝白斑筛选，获得含有重组BmNPV的白色大肠杆菌菌落，从大肠杆菌中提取BmNPV基因组DNA，并进行PCR鉴定，筛选出含有ω -MVIIA基因的重组BmNPV，将其命名为νΒπΓ?;
(4)重组病毒感染的家蚕血液的镇痛活性的验证:经脂质体转染获得重组病毒BV粒子(出芽型病毒粒子)，借助绿色荧光检测病毒滴度；用重组病毒的BV粒子注射家蚕，借助绿色荧光收集感染家蚕的血液，采用小鼠醋酸扭体法证实，该血液制备物具有显著的镇痛活性。
[0008]本发明的有益效果:
本发明根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)高效表达基因的密码子使用频率，优化了芋螺毒素ω-MVIIA基因序列，使之适合在BmNPV的天然宿主家蚕中表达。经化学合成密码子优化的芋螺毒素ω-MVIIA基因后，借助基因工程手段，ω-MVIIA基因导入BmNPV，获得重组病毒。小鼠醋酸扭体实验证实，受携带芋螺毒素ω -MVIIA基因的重组病毒感染的家蚕血液具有明显的镇痛活性，小鼠的平均扭体次数仅为3.55次，明显高于生理盐水对照组(37.30次)。本发明还在重组病毒中导入了绿色荧光蛋白(EGFP)基因，借助绿色荧光不仅能检测重组病毒BV粒子的滴度，还能检测接种病毒的家蚕是否有效感染重组病毒。利用本发明所述方法，有望利用易于饲养的家蚕大量表达具有镇痛活性的芋螺毒素ω-MVIIA，为其应用奠定基础。
【附图说明】
[0009]图1:基因的密码子优化。1:原始的基因序列，2:密码子优化的基因序列，3:编码的ω-MVIIA前体蛋白序列。
[0010]图2:重组BmNPV的PCR鉴定结果。M:DNA marker ； 1-4:重组BmNPV扩增产物。
[0011]图3:病毒感染的家蚕。1:普通BmNPV (vBm)感染的家蚕，无绿色荧光，2:感染重组BmNPV vBmMVD A/ESFP的家蚕，呈肉眼