枸杞谷胱甘肽合成酶基因与克隆方法及在耐逆性方面应用
【技术领域】
[000。 本发明设及一种构杞（如。心曲紐ineftse必/心如中谷脫甘肤合成酶基因及其在 增强植物耐盐碱能力方面的应用，具体为构杞中谷脫甘肤合成酶基因筑的克隆、重组 及应用。
【背景技术】
[0002]植物在生长发育过程中不断遭受各种生物及非生物的胁迫。如干旱、盐碱、寒冷、 高溫及病原菌的侵染等，与能移动的动物不同，植物在长期进化过程中发展起一套完善和 适合其自身需要的信号转导系统W适应环境变化，更好地生存。植物受到刺激后，会产生物 理或化学信号，运些信号到达祀细胞后转换成胞内信号，并启动细胞内各种信号转导系统， 继而对原初信号进行级联放大，使一些基因的表达受逆境调控，最终导致生理生化变化。
[0003]植物对干旱和高盐等逆境的抗性是受多基因控制的一个复杂的过程，而运些抗逆 基因的表达多是受逆境环境调控的，当植物感受到外界的生物、非生物胁迫信号时，机体的 逆境调控的抗逆相关基因才会表达。谷脫甘肤（Glutathione,G甜）是广泛分布于植物 和微生物细胞内最主要、含量最丰富的含琉基的低分子肤。1929年由化pkins最早发现并 对其予W命名，是一种由谷氨酸、半脫氨酸和甘氨酸组成的Ξ肤化-谷氨酷-L-半脫氨 酷-甘氨酸），分子式为。讯17〇苗吨。G甜作为生物体内主要的还原态硫之一，在生物体抵抗 各种胁迫（冷害、干旱、重金属、真菌等）的过程中起着重要的作用，其含量水平的高低与 植物对各种环境胁迫的忍耐程度密切相关，同时也可能是生物体内其调节作用的信号分子 之一。近些年来，它在高等植物代谢过程中的生理作用，尤其是在植物抵御活性氧伤害过程 中的作用及其与植物抗逆性关系的研究进展很快。
[0004]Bloch等最早研究了GSH的生物合成，并证实了细胞内的GSH是由丫-谷氨酷半 脫氨酸合成酶（丫-EC巧与GSH合成酶（G巧在ATP存在下催化L-谷氨酸α-精氨酸和甘 氨酸的序贯反应在细胞内合成的。GSH通过细胞膜时与分布在细胞膜外侧的γ-谷氨酷转 肤酶反应，G甜的丫 -谷氨酷部分便转移到某些氨基酸上。由此生成的丫-谷氨酷氨基酸 再被运进细胞并在γ-谷氨酷基环化转移酶的作用下裂解为相应的氨基酸和5-径基脯氨 酸。5-径基脯氨酸再在5-径基脯氨酸酶的催化下转化为k谷氨酸。在丫-谷氨酷转肤 酶的作用下生成的半脫氨酸甘氨酸部分则被半脫氨酸甘氨酸双肤酶作用，裂解为半脫氨酸 和甘氨酸，分别作为丫 -ECS和GS的底物。运6种酶催化的6个反应便组成了动物中GSH 合成和降解的丫-谷氨酷循环。GS和丫-ECS两种酶都已在植物组织中发现和纯化，而且功 能也已证实。两种酶在叶绿体和其他细胞器均有分布。
[0005] 高等植物体内谷脫甘肤的功能主要体现在W下几个方面：（1)维持细胞膜的完整 性、清除体内自由基；（2)参与氨基酸的吸收和转运，促进细胞合成蛋白质；（3)参与了氨 基酸的吸收，进而促进蛋白质的合成；（4)解毒作用；（5)GSH在重金属胁迫中起着重要 的作用；（6)谷脫甘肤参与植物环境胁迫的应答；谷脫甘肤分为氧化型（GSSG)和还原型 (GSH)。通常所说的谷脫甘肤为还原型谷脫甘肤，其半脫氨酸上的琉基是其发挥生物学功能 所必需的。还原型谷脫甘肤是植物中含量最丰富的含琉基的低分子肤，为植物机体内的重 要活性物质，它参与二硫化物、硫酸和硫醋的形成，并能清除生物体内的自由基，是胞内代 谢过程和植物遭受氧化胁迫时所产生的过氧化物的最有效的清除剂之一。植物机体内的氧 化型谷脫甘肤可W转化为还原型谷脫甘肤，还原型谷脫甘肤与氧化型谷脫甘肤含量的比值 是反映植物体内谷脫甘肤活性的重要指标之一。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种构杞谷脫甘肤合成酶基因（Zc货)。
[0007] 本发明的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质化cG巧。
[0008] 本发明的目的还在于提供含有该基因的重组载体（pMD18-T-LcG巧和宿主细胞 (畑5α)。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供该基因的用途。
[0010] 本发明提供的一种构杞谷脫甘肤合成酶基因Uc仿)，如序列表中SEQIDNo. 1所 示的核巧酸序列构成。
[0011] 本发明提供的一种构杞谷脫甘肤合成酶基因筑编码的蛋白质，如序列表中 SEQIDNo. 2所不的氨基酸序列的蛋白质。
[001引本发明提供的一种构杞谷脫甘肤合成酶基因筑的重组克隆载体pMD18-T-LcGS0
[0013] 含有上述的构杞谷脫甘肤合成酶基因筑的重组载体，运些重组载体包括质 粒。
[0014] 含有上述构杞谷脫甘肤合成酶基因筑的完整编码阅读框序列的宿主细胞，如 含有上述重组载体（pMD18-T-LcG巧的宿主细胞（D册α)也属于本发明的保护范围。
[0015] 本发明提供了一种含有基因的工程菌。
[0016] 本发明的克隆方法由下述步骤组成： 从构杞新鲜叶片中提取总RNA，根据转录组化igene序列中构杞谷脫甘肤合成酶基因 的核巧酸序列设计上游引物LcGS-Fl:5'-TCAAAGAGGTCAGGCACTGTTCC-3'（沈QIDNo. 3)， 1。65。斗2:5'-6446〇：了664176了4了67^了6-3'（沈9 10齡.4)然后利用3'^〔6方法扩增 得到谷脫甘肤合成酶基因的3'末端序列，将转录组化igene中的序列与得到的3'末端序 列拼接设计全长扩增引物GS-Full-F:ATGGGCAGTGGCTATTCCT(沈QIDNo. 5) ;GS-Full-R: TGTCTCTAGCAGAACAGTAAAGG(沈QIDNo. 6) ;PCR扩增获得构杞Zc齡的全长序列。
[0017] 本发明构建含谷脫甘肤合成酶基因Zc仿前大肠杆菌的中间载体pMD18-T-LcGS。 由下述步骤组成： WGS-Full-F/Ril1-R为引物，W构杞cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产 物连接于PMD18-T载体，获得含有序列表中SEQIDNO. 1所示的Zc仿基因的中间载体 pMD~18~T~LcGS〇
[0018] 本发明研究了构杞在不同时间的盐碱胁迫下，构杞谷脫甘肤合成酶的表达量的变 化，由下述步骤组成： 提取不同时间盐胁迫下构杞叶片的总RNA，测定RNA浓度，反转录合成CDNA，W LcGS-F2/GS-Full-R为引物，cDNA为模板，通过半定量PCR测定盐胁迫下构杞谷脫甘肤合成 酶的表达量。
[0019] 本发明研究了构杞在不同时间的重金属胁迫下，构杞谷脫甘肤合成酶的表达量的 变化，由下述步骤组成： 提取不同时间重金属胁迫下构杞叶片的总RNA，测定RNA浓度，反转录合成cDNA，W LcGS-F2/GS-Full-R为引物，cDNA为模板，通过半定量PCR测定盐胁迫下构杞谷脫甘肤合成 酶的表达量。
[0020] 本发明提供了一种构杞谷脫甘肤合成酶及其在增强构杞等植物耐逆性能力(例 如耐盐、耐重金属）方面的应用。通过提取新鲜构杞叶片中的总RNA，利用3'RACE方法克 隆构杞中的谷脫甘肤合成酶基因得到基因完整的序列为208化P，包含一个1683bp 的开放阅读框（0RF)，编码560个氨基酸，3'非编码区398bp，该基因的cDNA序列还包含 24bp的polyA尾。利用ExPASy数据库ProtParam软件在线分析的结果显示，其蛋白分子 量62. 65kD，理论等电点为6. 16。通过半定量PCR研究分析了构杞在不同时间盐胁迫和重 金属胁迫下的表达分析，进一步解明了构杞在胁迫下的应答机制。
[0021]
【附图说明】
[0022] 图1.LcGS-F2引物扩增Zc仿电泳图。
[002引 图2.Zc仿全长扩增电泳图。
[0024]图 3.pMD18-T-LcGS载体示意图。
[00巧]图4.LcGS与其它植物GS多重序列比对。
[002引图5.不同时间盐处理下Zc仿前表达分析。
[0027] 图6.不同时间重金属处理下前表达分析。
[0028]
【具体实施方式】
[0029] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件W及手册中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得 至IJ。实施例1 构杞中谷脫甘肤合成酶基因的3'末端克隆 利用化izol试剂，从lOOmg的新鲜的构杞叶片中提取totalRNA，根据转录组的 化igene序列设计上游引物，构杞中谷脫甘肤合成酶Zc仿基因的上游引物为：1^65斗1:5'-TCAMGAGGTCAGGCACTGTTCC-3'，LCGSF-F2:5 '-GMGCCTGGATTGTATGTTATG-3'，利用3'FULLRACE Core Set Ver. 2.0 (TaKaRa，Japan)试剂盒扩增得到LcGS基因的3'末端序列。具体步 骤：①Wtotal RNA为模板，利用3'RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成1st Strand cDNA，反应体系如下：
反应条件：42°C，60min;70°C，15min。
[0030] 根据基因的上游引物与试剂盒提供的下游引物3'RACEoutprimer:5'-TACCGTCG TTCCACTAGTGATTT-3'，WlStStrandcDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：
反应条件如下：94°C，4min; 94°C，30Sec;56°C，30Sec;72°C，90Sec;34 巧cle， 72°C，lOmin。将上述PCR扩增产物稀释40倍取1. 5uL作为模板，WLcGS-F2/3'RACEout primer为引物，其他反应液与上述条件一致，反应条件如下：94°C，4min; 94°C，30Sec; 56°C，30Sec;72°C，70Sec;