一种猪伪狂犬病病毒、疫苗组合物及其制备方法和应用
【专利说明】-种猪伪狂犬病病毒、疫苗组合物及其制备方法和应用
[0001] 本申请为专利申请2014102412792的分案申请，原申请的申请日为2014年5月28 日，发明创造名称为一种猪伪狂犬病病毒、疫苗组合物及其制备方法和应用。
技术领域
[0002] 本发明设及一种疫苗组合物，属于动物病毒学领域。
【背景技术】
[0003] 伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由瘤疹病毒科化erpesviridae)α亚科中的猪 瘤疹病毒I型（Suidhe巧esvirus1strain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生 动物的一种W发热、奇痒（除猪外）及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国 广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死 胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻搏，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜 伏感染特性，在外周神经系统可W长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒， 被潜伏感染的宿主就会发病。
[0004] 研究表明亚单位疫苗能够给免疫动物提供相应的保护，亚单位疫苗是利用基因工 程方法将病原保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫 苗。目前发现伪狂犬病毒糖蛋白中的浊、gC、曲均能使机体产生中和抗体，运些抗体无论是 在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和PRV的能力。"伪狂犬病亚单位疫苗 研究进展"（杨承槐，类高明，湛南辉《江西畜牧兽医杂志》2004年第3期）公开了在伪狂犬 病病毒目前已发现的11种糖蛋白中，浊、gC、曲均能诱导机体产生中和抗体。在没有补体 的参与下，浊、gC、曲的单克隆抗体能中和PRV。猪和小鼠注射抗浊、gC、曲的单克隆抗体 均能抵抗PRV强毒的攻击。因此，浊、gC、曲是研制PRV亚单位疫苗的首选蛋白。糖蛋白曲 是一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标，能诱导较好的保护反应。US6858385 和US6521231公开了利用猪伪狂犬病病毒曲蛋白可W制备疫苗用于猪伪狂犬病的预防。
[0005] 猪PRV只有一个血清型，通常认为毒株的交叉保护力很强，但目前仍存在仔猪注 射商品化疫苗后发生典型猪伪狂犬病，例如长时间体溫升高，精神沉郁，食欲减退，出现呼 吸道和/或神经症状。突出表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短 (1~2天），发病率在10%~100%之间，发病猪死亡率在10%~100%之间（仔猪死亡率 可高达100% )，感染后可引起猪只高热（40~42°C，持续3日W上），呼吸困难，腹泻，喘， 咳嗽，打喷暧，后肢麻搏，犬坐，突然倒地，抽摇，侧邸不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而 死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产（高达35% )，早产，死胎，弱仔（弱仔14 日龄前全部死亡）等繁殖障碍症状。现有技术的疫苗免疫猪只后不能完全抵抗野毒攻击， 依然会出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝等症状，感染率超过80 %，发病率超过30 %， 死亡率在10%~20%之间。现有技术还没有疫苗能够解决针对猪伪狂犬变异株引起的伪 狂犬病。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术的不足，本发明旨在提供一种猪伪狂犬病病毒株，该猪伪狂犬病 病毒株可用于制备疫苗，通过动物实验证明该疫苗对于猪伪狂犬病具有良好的免疫作用。
[0007] 本发明提供了一种核巧酸序列，所述核巧酸序列实质上编码序列表SEQIDNO. 1 所示的蛋白。
[0008] 本发明提供了一种核巧酸序列，所述核巧酸序列实质上编码序列表SEQIDNO. 2 所示的蛋白。
[0009] 本发明提供了一种核巧酸序列，所述核巧酸序列实质上编码序列表SEQIDNO. 3 所示的蛋白。
[0010] "编码序列"在本申请中是指一种DNA序列，其能够被转录得到相应的RNA序列。
[0011] 为解决现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种猪伪狂犬病病毒株，其中， 所述猪伪狂犬病病毒株具有序列表SEQIDNO. 4所示的核巧酸序列编码的曲糖蛋白。
[0012] 本发明术语"曲糖蛋白"，是猪伪狂犬病病毒进行感染必需的结构蛋白，是成熟的 病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也称为甜50蛋白。
[0013] 本发明术语"同源性"在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核巧酸序列的相 似程度。氨基酸序列或核巧酸序列的同源性可W通过本领域公知的任何适当的方法计 算得到，例如，可W将目标氨基酸（或核巧酸）序列与参比氨基酸（或核巧酸）序列进行 序列比对，必要时可W引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸（或核巧酸）数目 达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸（或核巧酸）序列之间相同氨基酸（或核巧 酸）的百分比。氨基酸（或核巧酸）序列的比对和同源性的计算可W通过本领域公知的 软件实现，例如，但不限于，BLAST软件（在美国国立生物技术信息中屯、（NCBI)的网址上 可获得：ht1:p://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，AltschulS.F.et al,J.Mol.Biol. , 215 :403-410 (1990)；StephenF.etal,NucleicAcidsRes. ,25： 3389-3402(1997))，ClustalW2软件（在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://丽w. eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例女日，HigginsD.G.etal,MethodsinEnzymology, 266:383-402(1996);LarkinM.A.etal，Bioinformatics(Oxford,England) ,23(21): 2947-8(2007));和TCoffee软件等（在瑞典生物信息学研究所的网站上可W获得： http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例女曰，Poirot0.etal,NucleicAcidsRes. ,31(13) :3503-6(2003)；NotredameC.etal,J.Mol. Boil.，302 (1) :205-17 (2000))。使用软件进行序列比对时，可W使用软件提供的默认参数， 或者也可W根据实际情况对软件提供的参数进行调整，运些都在本领域技术人员的知识范 围内。
[0014] 优选地，所述猪伪狂犬病病毒株具有序列表SEQIDNO. 5所示的核巧酸序列编码 的浊糖蛋白。
[0015] 优选地，所述的猪伪狂犬病病毒，它具有SEQIDNO. 2的氨基酸序列的浊糖蛋白。
[0016] 优选地，根据本发明的所述猪伪狂犬病病毒，它具有SEQIDNO. 3的氨基酸序列的 gC糖蛋白。
[0017] 优选地，所述猪伪狂犬病毒株为HN1201株（Pseudor油iesvirus,strainHN1201) 或其培养物，保藏号为CCTCCNO.V201311;保藏于中国典型培养物保藏中屯、；保藏地址为 中国武汉市?武汉大学，保藏日期为2013年5月20日。
[0018] 所述术语"培养物"是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次 之间其基因序列仅可能会发生微小的变异，优选地，所述培养物是5-35代W内的培养物。
[0019] 本发明的另一个目的是提供一种猪伪狂犬病病毒疫苗组合物，其中，所述疫苗组 合物包括免疫量的猪伪狂犬病病毒株的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成疫苗或基 因工程疫苗。
[0020] 优选地，所述疫苗组合物包括免疫量的所述猪伪狂犬病病毒株HN1201株或其培 养物的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肤疫苗或基因工程疫苗。
[0021] 优选地，本发明的疫苗组合物包含所述猪伪狂犬病病毒或其抗原作为活性成分。 用于疫苗的组合物的猪伪狂犬病病毒具有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列或与其共有98% W上 同源性的氨基酸序列表示的曲糖蛋白。
[0022] 优选地，所述疫苗组合物的猪伪狂犬病病毒为HN1201株或其培养物。
[0023] 用于本发明的抗原是指病毒组分的抗原部分，它引起免疫应答，并可包含具有与 SEQ ID NO. 1的氨基酸序列。
[0024] 可选择地，抗原可包含具有SEQ ID NO. 2的氨基酸序列或其片段共有95% W上核 巧酸同源性的浊蛋白。<