一种改造的中国明对虾抗菌蛋白基因ALFm的重组表达及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程，尤其是设及一种改造后的中国明对邮抗菌蛋白基因ALFm 的重组表达和应用。
【背景技术】
[0002] 对邮养殖是海水养殖的支柱产业之一，随着市场对优质水产品需求量的不断增 长，邮类养殖在水产养殖中占据越来越重要的地位。然而，邮类病害的爆发性流行使对邮养 殖遭受了巨大损失，多种细菌病毒引发的对邮疾病频发困扰着对邮养殖业的发展。目前抗 生素、激素类等药物在水产养殖上，虽然对病害控制起到一定的作用，但也破坏了水环境及 动物体内的微生态平衡，使水产动物失去了正常的菌群屏障及生物括抗作用，同时抗生素 的滥用也将导致细菌产生耐药性，变异出致病性更强、危害性更大的致病微生物。因此开发 特异的生物制品药物来替代传统抗生素的任务十分紧迫。
[0003] 对邮抗菌肤是一类基因编码的小分子多肤，在先天性免疫中起到了重要作用。它 们，一般带有正电荷，能够对某些细菌、真菌和病毒等具有较强的杀伤作用。同时，与传统抗 生素相比，抗菌肤作为多肤抗生素具有无污染，针对性强，不易产生耐药性等特点，是解决 对邮病害问题的重要突破口。
[0004] 抗脂多糖因子（Anti-1ipopolysaccharidefactor,ALF)作为甲壳动物的一 类抗菌肤，具有广谱的抗菌活性W及识别结合脂多糖的能力，作为先天性体液免疫的重 要效应分子，可W直接杀灭病原，在先天性免疫反应中起着至关重要的作用，也是近年来 抗菌肤类的研究热点。在前期的研究中，申请人所在项目组分析了 7种中国明对邮不同 功能域（LPSbindingdomain)的抗菌及抗病毒活性，并通过结构改造证实了其关键的 氨基酸位点和结构特征。一种WFCALF2的LI^结合结构域为原型，经过改造后的短肤 CKFKVKPKFKRWKLKFKGRMWC表现出了较强的抗菌活性。但是使用化学方法合成小肤的成本 高，产量少。而利用生物工程的手段，通过工程菌株，则能够分离纯化出具有生物活性的，大 量的ALF功能域小肤，成体较低，可W用于大规模制备。
【发明内容】
阳〇化]目的在于提供一种抗菌蛋白基因的改造方法及其高效重组表达和应用。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] 改造后的抗菌蛋白ALFm基因：具有序列表SEQIDNo. 1中的碱基序列及SEQID No. 2所示的氨基酸序列。
[0008] 所述ALFm基因的重组表达：进行密码子优化并合成ALFm基因，构建真核重组表达 载体pPIC9K-ALFm，电转化到酵母菌株，鉴定阳性克隆，并通过甲醇诱导表达，筛选出表达量 较高的菌株，通过Ni2+亲和层析柱，纯化出具有活性的重组抗菌蛋白，并检测其活性；具体 为：
[0009] 1.基因的改造和合成
[0010] 用氨基酸序列CKFKVKPKFKRWKLKFKGRMWC替换来源于中国明对邮FcALF2基因（基 因注册号：JX853775)编码氨基酸序列中的CSFNVTPKFKRWQLYFRGRMWC序列，获得具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的ALFm蛋白序列，并在3'末端加上组氨酸标签序列，将其反译成 核巧酸序列，并根据酵母表达的密码子偏好性，进行密码子优化，获得SEQ ID No. 1所示的 碱基序列（图1)。
[0011] 2.重组表达载体及宿主菌的选择
[0012] 确定使用PPIC9K为真核表达载体，使用毕赤酵母GS115为表达宿主菌。
[0013] 3.重组表达载体的构建
[0014] 利用内切酶将目的基因从PUC57上剪切下来，连入到PPIC9K载体中，构建重组表 达载体pPIC9K-ALFm，将其转化到大肠杆菌D册α感受态细胞中，利用PCR技术检测阳性菌 株（图2)。
[0015] 4.转化与筛选
[0016] 大量提取重组表达载体pPIC9K-ALFm，用SalI内切酶单酶切表达载体，并电转化 到酵母菌GS115中，挑选单克隆菌，进行PCR检测，筛选出阳性工程菌（图扣。
[0017] 5.甲醇诱导表达小试
[001引挑选阳性克隆，在BMMY液体培养基中培养，用甲醇进行诱导，使用Dot-Blot(Anti-His抗体）来检测上清中的蛋白表达，筛选高表达菌株进行扩大培养。
[0019]6.扩大培养及重组蛋白分离纯化
[0020] 选择用Dot-Blot检测表达量高的菌株，进行扩大培养。用甲醇进行诱导表达，7化 后离屯、收集上清，经阳G20000浓缩后，用Ni-IDA-S巧harose化-她亲和层析柱进行纯化， 收集流出液，并将上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(抑7.4)进行过夜透析，并 用12%SDS-PAGE电泳分析（图4A)。
[0021] 7. Western-blot和质谱检测
[0022] 将纯化后的蛋白质进行电泳检测，并转到PVDF膜上，由于ALFm蛋白含有His标 签，用HRP标记的抗化S标签抗体进行Western-blot检测（图4B)。同时对纯化后的蛋白 进行MLDI-T0F-MS检测，分析重组蛋白分子量（图5)。
[0023] 所述的改造后的抗菌肤重组蛋白对革兰氏阳性菌和阴性菌的生长均具有抑制作 用，同时该重组蛋白与WSSV病毒解育后，能显著抑制病毒的感染活性。
[0024] 本发明有如下优点：
[00巧]1.本发明对一种中国明对邮抗菌蛋白基因FCALF2的功能域进行替换改造后，反 译成核巧酸序列，并进行密码子优化，更有利于目的序列在酵母中进行重组表达。
[00%] 2.利用本发明中使用的重组表达载体及宿主菌，能够成功表达出具有抗菌和抗病 毒活性的重组蛋白。
[0027] 3.意义深远。本发明可开发有效的对邮细菌性和病毒性疾病的防治制剂。同时， 为其他具有抗菌活性蛋白的重组表达研究提供了新的思路。
【附图说明】 阳02引图1ALFm的序列信息，（A)ALFm的核巧酸和氨基酸序列；度）重组ALFm蛋白的结 构；(C)ALFm序列密码子偏好性检测；
[0029] 图2重组质粒PPIC9K-ALFV的PCR检测；
[0030] 图 3PCR检测重组酵母菌GS115-PPIC9K-ALFV;
[0031] 图4重组表达蛋白ALi^的SDS-PAGE检测和Western-Blot检测，
[0032] A，LaneΜ:P;roteinMarker;Lane1 :诱导后 72 小时；Lane2 :流出液；Lane3 :洗 脱液；
[0033] B，western-blot检测ALFm表达；
[0034] 图5ALFm纯化蛋白的质谱鉴定；
[0035] 图6利用抑菌圈法检测重组蛋白ALFm的抑菌活性；A大肠杆菌巧溶藻弧菌；C芽 抱杆菌；D藤黄微球菌；
[0036] 图7重组蛋白A1A抗WSSV活性。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。 阳0測实施例
[0039] 改造后的中国明对邮抗菌蛋白基因ALFm,具有如下序列： 柳4〇] (1)SEQIDNo. 1的信息（参见序列表） 阳OW(a)序列特征W42] *长度：327碱基对 阳0创 *类型：核酸
[0044] *链型：双链 W45] *拓扑结构：线性
[0046] 化）分子类型：cDNA
[0047] (C)假设杏
[0048] (d)反义杏
[0049] (e)最初来源：中国明对邮（Fenneropenaeuschinensis) 阳化0] 序列描述：SEQIDNo. 1
[0052] CATCATCATCATCATCAT
[0053] (2)沈QIDNo. 2 的信息
[0054] (a)序列特征 阳化5] *长度：109氨基酸残基
[0056] *类型：氨基酸 阳057] *链型：单链 阳05引 *拓扑结构：线性
[0059] (b)分子类型谨白
[0060] 序列描述：SEQIDNo. 2
[0061] 孤孤KSGWEALVPAIADKLTGLWESGELELLGHYCKFKVKPK
[0062] FKRWKLKFKGRMWCPGWTTIGGQAETRSRSGVVGRTTQDFV服
[0063] AFRAGLITESEAQAWLNNHHHHHH
[0064] 一种改造的中国明对邮抗菌基因ALFm的体外重组表达、分离纯化及生物活性分 析： 阳0化]在中国对邮FcALF2的基础上进行改造，用CKFKVKPKFKRWKLKFKGRMWC替换原有的 功能域序列CSFNVTPKFKRWQLYFRGRMWC，反译成核巧酸序列，并合成该基因。利用酵母表达系 统，获得了具有活性的重组抗菌蛋白。具体如下：
[0066] 1)基因合成 阳067] 根据改造好的序列，合成该基因SEQIDNo. 1，将该序列连接于PUC57载体中。
[0068] 2)重组表达载体的构建
[0069] 利用EcoRI和NotI内切酶，双酶切