H9亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔgE-H9株的构建及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及册亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔ姐-册株的构建及其应用，属于 病毒学和兽用生物制品领域。
【背景技术】
[0002] 鸭肠炎病毒值uckenteritisvirus,DEV)，又名鸭攝病毒，可感染鸭、碟及其它雁 形目禽类，引起血管损伤、组织出血、消化道粘膜损伤、淋己器官受损和实质性器官退行性 病变的一种急性、接触性、败血性传染病一一鸭病毒性肠炎值uckviralenteritis,DVE)， 或称鸭攝值uckplague,DP) (San化uandMetwally, 2008)。自1923年被首次发现W来 度audet，1923)，本病相继发生于法国、印度、比利时、英国、泰国和加拿大等国家（殷震和 刘景华，1997)，流行范围、感染禽类的种类有逐步扩大的趋势，至少48种雁形目中的禽类 对DEV易感化aletaet曰1.，2007)。鸭攝是一种广泛嗜全身性感染的传染病，发病率和死 亡率都很高，给水禽养殖业带来巨大损失。免疫接种是预防和控制该病暴发的重要措施，目 前我国用于鸭攝预防的疫苗主要是上世纪60年代研究成功的鸡胚弱化活疫苗。DEV具有良 好的免疫原性，免疫力产生快速，免疫后3天便可抵抗鸭攝强毒攻击；免疫期长，可达一年。
[0003] DEV属于瘤疹病毒科、甲型瘤疹病毒亚科、马立克病毒属、鸭瘤疹病毒1型 (ht1:p://www.ictvonline.org)。李玉峰应用Shot-gun方法首次完成了DEV--我国鸭 攝商品化疫苗值EVVAC)的全基因组测序。DEVVAC基因组全长为158,089bp，G+C含量 为44. 91%，由长独特区OJniqueLong，UL)和短独特区OJniqueShod，U巧组成，US区两 端为一对反向重复序列，分别称为内部重复序列（InternalRepeat,IR)和末端重复序列 灯erminalRepeat，TR)。基因组结构为UkIR-US-TR，呈典型的D型瘤疹病毒基因组结构 (Lietal.，2009)。我们完成了我国鸭肠炎病毒强毒参考株全基因组序列测定，该毒株基 因组全长为162, 13化P，共78个0RF，编码76个蛋白（Yangetal.，2014)。
[0004] 自1994年在我国广东某鸡场分离到H9N2亚型禽流感病毒W来，该亚型病毒在我 国的鸡、鸭、碟等禽类中广泛流行，一直呈上升趋势，对鸭致病性逐渐增强，可引起蛋鸭产蛋 量下降，沙壳蛋增多，使维鸭出现呼吸道症状和亚临床症状，此外，还可引起免疫抑制，造成 鸭群继发大肠杆菌等疾病，对养鸭也造成重大经济损失。 阳0化]随着基因工程技术的发展，重组病毒活载体疫苗成为当前新型疫苗研究的热点。 利用基因工程技术，将外源DNA插入到病毒基因重组，利用病毒表达外源DNA蛋白，制备成 一种活载体疫苗。运种疫苗可W同时启动机体细胞和体液免疫，可W通过一次免疫预防多 种疾病，降低了生产成本，简化了免疫程序，还能克服不同病毒弱毒疫苗之间的干扰现象。 [0006] 本发明通过同源重组技术，构建了一株缺失姐基因143-509位核巧酸、带有GFP 标记的重组rDEVΔ姐-GFP，然后应用绿色巧光蛋白负筛选技术，获得了表达册亚型禽流感 病毒血凝素（HA)基因的重组鸭肠炎病毒rDEVΔ姐-册。该重组病毒免疫鸭后，能抵抗DEV 强毒株的攻击，还能诱导较高的H9HI抗体。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种表达H9亚型禽流感病毒血凝素（HA)基因的重组鸭肠 炎病毒，即本发明先构建一株缺失姐基因、携带绿色巧光蛋白基因（GF巧标记的重组鸭肠 炎病毒rDEVΔ姐-GFP株，然后应用绿色巧光蛋白负筛选技术，获得了表达H9亚型禽流感病 毒HA基因的重组鸭肠炎病毒rDEVΔ姐-册株。将重组鸭肠炎病毒rDEVΔ姐-册株制备成 活疫苗，可预防鸭攝和H9亚型禽流感。 阳00引本发明的技术方案 W09] 1. -株重组鸭肠炎病毒，其特征在于该毒株被命名为鸭肠炎病毒值uck enteritisvirus,DEV)rDEVA姐-册株，该病毒株已于2015年11月11日送交北京市朝阳 区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中屯、保藏，保藏编号为：CGMCCNo.11498。
[0010] 2.如权利要求1所述一株重组鸭肠炎病毒，其特征在于该毒株的姐基因内插入了 册亚型禽流感病毒血凝素（HA)基因。
[0011] 3.如权利要求1所述一株重组鸭肠炎病毒的应用，其特征在于该毒株作为疫苗生 产毒株应用于制备H9亚型禽流感鸭肠炎病毒二联活疫苗，预防H9亚型禽流感和鸭攝。
[0012] 4.如权利要求1、2所述一株重组鸭肠炎病毒的应用，其特征在于是将该株病毒接 种长满单层的无特定病原鸡的鸡胚成纤维细胞，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真 空干燥制成所述H9亚型禽流感鸭肠炎病毒二联活疫苗。
[0013] 5.如权利要求1、2所述一株重组鸭肠炎病毒的应用，其特征在于该株病毒缺失了 姐基因143-509位核巧酸，可在此区域插入册亚型禽流感病毒或/和鸭肝炎病毒或/和鸭 黄病毒保护基因并获得稳定、高效表达，制备成鸭肠炎病毒为载体的联合活疫苗。
【具体实施方式】
[0014] 1.生产用病毒毒种
[0015] 本发明所述的疫苗其生产毒种为表达册亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭肠炎病 毒（rDEVΔ姐-H9株），该病毒构建方法如下：
[0016] (1)载体
[0017] PMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程（大连）有限公 司。含有CMV启动子、polyA的GFP报告基因载体pT-GFP-甜t(见图1)，由本发明人所在实 验室构建、保存。
[0018] 似引物设计
[0019] 根据GenBank上发表的DEV序列设计合成W下引物：
[0020] 表1本发明构建所设及的相关引物信息
[0021]
[0022] (3)含GFP标记的鸭肠炎病毒rDEVΔ姐-GFP株的构建
[0023] 1)转移载体ρΤ-姐-GFP-甜t的构建
[0024]W鸭肠炎病毒（鸭肠炎病毒值uckenteritisvirus,DEV)CVCCAV1221株）基因 组DM为PCR扩增模板，W引物U姐F、U姐R扩增姐基因的左端13"bp片段。W引物US8F、 US8R扩增姐基因的右端1323bp片段。扩增目的片段分别连接PMD-18T载体，构建相应的 重组质粒ρΤ-姐U和ρΤ-姐d。用Sail和化ndlll双酶切上述重组质粒，分别回收3900bp和 1300bp片段，获得重组质粒ρΤ-姐ud。将重组质粒ρΤ-姐ud用Sail酶切，电泳回收后去憐酸 化；pT-GFP-甜t用Sail酶化电泳回收2. 1化片段，将GFP-甜t表达盒插入到ρΤ-姐ud中， 获得转移载体ρΤ-姐-GFP-甜t。 阳0巧]2)同源重组
[0026] 按照Lipofectamine?2000转染试剂（Invitrogen公司）盒说明书，将转移载体 ρΤ-姐-GFP-gpt与DEV进行转染鸡胚成纤维细胞（CE巧。具体步骤如下：
[0027] 六孔板中的C邸培养至长成70%~90%细胞单层时，接种适量的DEV，吸附1~ 4小时；将1μg转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积 均为50μレ室溫解育5min;取2μΙLipofectamine2000与48μΙ不含血清和抗生素的 opti-DMEM轻轻混匀，室溫解育5min;将50μLLipofectamine2000稀释液分别滴加到 50μΙ质粒稀释液中，边加边混匀；室溫解育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血 清0PTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入0. 5血无血清0PTI-MEM，将100μLLipofectamine 2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37°C培养4h，弃去上清， 加入10%胎牛血清的^99培养基，置37°(：培养2地后，用1%胎牛血清的^99培养基换 液，置37°C培养3~5d，每天观察，直至出现重组病毒巧光斑。
[0028] 3)重组病毒的蚀斑纯化
[0029] 将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板C邸细胞，吸附1小时 后，弃去吸附液，铺上1 %的低烙点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在巧光显微镜下观察 绿色巧光，挑选单个巧光蚀斑于0. 5mlM199营养液中，冻融1次后接种6孔板C邸细胞，如 此进行蚀斑纯化3~4次，将获得的重组病毒命名为rDEVΔ姐-GFP。
[0030] 4)重组病毒rDEVΔ姐-GFP株的鉴定
[0031] 采用RE-姐-JD-F1、RE-姐-JD-R1特异性引物进行PCR扩增鉴定，PCR产物测序证 实，重组病毒缺失了姐基因，并成功插入了GFP标记基因。 阳