用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控芯片及其观测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控 忍片及其观测方法。
【背景技术】
[0002] 细胞迁移参与了组织器官形成、组织损伤修复等重要生理过程；细胞迁移功能失 调，则会导致肿瘤细胞侵袭及转移。通过促进或抑制细胞迁移可影响某些疾病（缺血性屯、 血管疾病、肿瘤）的发生发展与转归，因此研究细胞迁移具有重要的理论意义与实用价值。
[0003] 目前，传统的测定细胞迁移方法W细胞趋化小室法度oyden化amber)和划痕法最 常用。前者由上、下两室组成，中间W微孔滤膜隔开。趋化因子加入下室，形成浓度梯度，细 胞接种在上室，受趋化因子浓度梯度的影响，穿过膜上的微孔移动到另一侧。之后，细胞固 定、染色和计数，W此确定其迁移能力。后者是用移液枪头在融合细胞上划出一道划痕，观 察细胞向划痕区域的迁移情况，来判断细胞的迁移能力。
[0004] 微流控忍片（微流控技术），是微加工技术的产物。由于其通道尺寸与哺乳类细胞 线性尺寸相比拟，多维网络结构与生理状态下细胞的空间特征相接近，已被广泛用于细胞 生物学研究。Nie等于2007年提出一种利用层流形成细胞划痕的微流控忍片，见参考文献 1。 化eng等于2008年提出一种直流电结合化学表面修饰实现细胞迁移的方法，见参考文献 2。 与传统方法比较，微流控技术具有尺寸可比拟，可控性好，精度高等优点。该些研究均说 明了通过微流控技术研究细胞迁移的可行性。 阳〇化]在实现本发明的过程中，申请人发现现有的基于微流控的划痕技术，通量普遍较 低，针对一个划痕实验的成本较高，难W大范围应用。
[0006] 参考文献1 :0n-Chip cell migration assay using microfluidic channels， Biomaterials 28(2007)4017-4022；
[0007] 参考文献2 :An automatic and quantitative on-chip cell migration assay using self-assembled monolayers combined with real-time cellular impedance sensing，L曰b On曰Chip-Mini曰turis曰tion for chemistry，biology&bioengineering， Volume 8,Number 6,June 2008,化ge 837-992。
【发明内容】
阳00引（一）要解决的技术问题
[0009] 鉴于上述技术问题，本发明提供了一种用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控忍 片及其观测方法，W实现大序列细胞划痕迁移观测实验。
[0010] (二）技术方案
[0011] 根据本发明的一个方面，提供了一种用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控忍 片。该微流控忍片包括：基底W及固定于基底上方的功能层；其中，在功能层上形成功能小 室阵列，在该功能小室阵列中各功能小室底部基底部分的上表面形成有电性隔离的第一电 极和第二电极。
[0012] 优选地，本发明微流控忍片中，第一电极为划痕电极，第二电极为加电电极，划痕 电极上修饰具有抗蛋白吸附功能基团的分子，功能小室内具有细胞悬液；具有抗蛋白吸附 功能基团的分子阻止细胞在划痕电极上吸附；当加电电极和划痕电极之间是加正向电压 时，抗蛋白吸附的分子从划痕电极上脱离，细胞能在划痕电极上吸附。
[0013] 根据本发明的再一个方面，还提供了一种利用上述微流控忍片进行细胞迁移观测 的方法。该方法包括：步骤S202:用膜蛋白酶消化细胞，并用培养基重悬，并将悬浮状态的 细胞接种至微流控忍片的功能小室；；步骤S204 :培养功能小室内的细胞，直至细胞在划痕 电极W外的地方贴壁生长；步骤S206 :在划痕小室的划痕电极和加电电极之间施加电压， 并持续预设时间，使具有抗蛋白吸附功能基团的分子从划痕电极上脱离；步骤S208 :移除 含有抗蛋白吸附分子的培养基，更换成含有实验需要的趋化因子的培养基，拍照记录预设 时间后细胞向划痕电极迁移的情况。
[0014] (S)有益效果
[0015] 从上述技术方案可W看出，本发明用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控忍片及 其观测方法具有W下有益效果：
[0016] (1) 一次最多可W实现384组平行实验，通量高，从而大大降低了实验成本，并且， 理论上来讲，忍片可W重复利用，使用过的忍片经过清洗和无菌处理后，可W再次进行硫醇 修饰，投入到划痕实验中，运又再次大大降低了实验成本；
[0017] 似用电极控制划痕边界，用加电压的方法去除具有抗蛋白吸附功能基团的分子， 可W保证各个划痕小室间划痕一致，且细胞和基质在此过程中不会受损，因此迁移结果精 准可信。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控忍片设计原理的示意图；
[0019] 图2为根据本发明实施例用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控忍片的结构示 意图；
[0020] 图3为图2所示微流控忍片制备方法的流程图；
[0021] 图4为图3所示微流控忍片制备方法中执行各步骤之后的划痕小室的剖面图；
[0022] 图5为图2所示微流控忍片观测方法的流程图；
[0023] 图6为图5所示微流控忍片观测方法中执行各个步骤之后的划痕小室内细胞状态 的不意图。
【具体实施方式】
[0024] 在对本发明进行介绍之前，首先对其设计原理进行说明。有一种功能基团为聚乙 二醇长链（PEG)的硫醇分子。PEG功能基团具有抗蛋白吸附的特性。因此，如果将具有PEG 功能基团的硫醇分子修饰到金属电极上的话，就可W阻止细胞吸附在电极表面。并且，在一 定电压下，硫醇分子还可W从金属电极上脱离，从而细胞又可W在电极表面吸附生长了。
[0025] 本发明将上述设计原理、微流控忍片技术与划痕实验相结合，提供了一种能够高 通量的，可W实时观察细胞迁移的微流控忍片，并同时给出该微流控忍片的观测方法。
[0026] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，W下结合具体实施例，并参照 附图，对本发明进一步详细说明。
[0027] 在本发明的一个示例性实施例中，提供了一种用于大序列细胞划痕迁移观测的微 流控忍片。请参照图2,本实施例用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控忍片包括：基底W 及固定于基底上方的功能层。
[0028] 本实施例中，基底采用透明玻璃。而在本发明其他实施例中，还可W采用有机塑 料、Al2〇3片、MgO片作为基底制作微流控忍片。
[00巧]本实施例中，功能层由聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，简称PDM巧制 作，厚度为5mm，其上形成有划痕小室阵列，共16行24列共384个正方形的划痕小室。
[0030] 请参照图2中C图，该划痕小室为向上开口的正方形小室，其边长3. 7mm，相邻两划 痕小室的中屯、间距4. 5mm，与标准384孔板尺寸一致。在结构上，该微流控忍片与传统多孔 板技术兼容，完全适应现有的多孔板平台。
[0031] 可W理解的是，划痕小室的横截面形状不局限于正方形，其也可W是长方形、圆 形，Ξ角形等其他规则或不规则图形。并且，划痕小室的数量也不局限于384,也可W是96、 24、12、6等其他标准规格多孔板的孔的数量，或者是设计者规定的其他数量。
[0032] 如图2中C所示，每一划痕小室底