一种针对丙型肝炎病毒包膜蛋白e2的单克隆抗体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫化学、基因工程和细胞生物学领域。具体而言，本发明的目的在于 制备一种与丙型肝炎化巧atitisCvirus,HCV)包膜蛋白E2相结合的单克隆抗体的杂交 瘤；由该杂交瘤产生的抗HCV包膜蛋白E2单克隆抗体及其相应产品可应用于人感染HCV的 诊断试剂或用于治疗或预防HCV感染的药物制备。
【背景技术】
[0002] HCV感染人体后，约80%HCV感染者常发展成为慢性肝炎，其中约有10% -20% 患者发展肝硬化、肝癌（AscioneA,TartaglioneT,DiCostanzoGG.化 1:ura化istoiT ofchronichepatitisCvirusinfection.DigLiverDis.2007,39Suppl1:S4-7 ； JacobsonIM,DavisGL,El-SeragH,NegroF,TrepoC.Prevalenceandchallenges ofliverdiseasesinpatientswithchronichepatitisCvirusinfection.Clin GastroenterolHepatol. 2010, 8:924-933;quizel17)，严重影响人类健康，目前尚无有 效的疫苗。目前，在HCV的治疗方法上取得了重大的进步，对一些型别的HCV能达到95% W上的治愈率，但仍然有一些抗药性毒株，且HCV具有高度变异性和异质性，在治疗过程 中可能很快产生抗性突变毒株巧iceCM,SaeedM.胎patitisC:Treatmenttriumphs. 化化re. 2014, 510:43-44)。因此，从多种途径上研制针对HCV的中和性抗体W及疫苗仍然 非常迫切。
[0003]HCV是有包膜的单股正链RNA病毒，其基因组RNA全长约9. 6化，由5'UTR(~ 34化P)、3'UTRW及中间的一个长的开放阅读框组成（〇!〇〇化,RichmanKH,HanJH,Berger Κ,LeeC,DongC,GallegosC,CoitD,Medina-SelbyR,BarrPJ,etal.Genetic organizationanddiversityofthehepatitisCvirus.ProcNatlAcadSciUS A. 1991,88:2451-2455)。HCV感染细胞后，其基因组能编码产生约3000个氨基酸的多聚蛋 白，该多聚蛋白在共转运和翻译后转运过程中，经过病毒和宿主细胞内蛋白酶的剪切，最终 形成10种蛋白：3种结构蛋白（核衣壳蛋白Core、包膜蛋白E1和E2)和7种非结构蛋白 P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B(GrakouiA，WychowskiC,LinC,化instoneSM,Rice CM.Expression曰ndidentific曰tionofhep曰titisCviruspolyproteincle曰v曰ge pro化cts.JVirol. 1993,67:1385-1395)。非结构蛋白不会被包装至病毒粒子中。整个病 毒粒子是由RNA和core蛋白形成核衣壳，包膜糖蛋白E1和E2组成病毒外壳的主要成分。
[0004] 在病毒感染的早期阶段，由E2与肝细胞表面CD81受体W及清道夫受体BI(SRB1) 直接相互作用，介导病毒入侵肝细胞，同时，E2也是中和抗体结合的主要祀点。因而，开发 针对E2的中和性抗体将能够在第一步抑制病毒入侵细胞。
[0005] 抗体的产生与抗原表位息息相关。成熟的E2蛋白（翻译后剪切掉N端20个 氨基酸信号肤的）大致可分为两个区域：N端的胞外区（aa384-661，对应于HCV多聚 蛋白上的位置）W及C端的疏水区（aa661-746)。一般抗原表位被认为存在于胞外亲 水区。而E2的胞外结构域含有Ξ个高度变异区：HVRl(384-410aa)、HVR2(474-482aa)、 IgV民(431-466aa)(Helle F, Duverlie G,Dubuisson J. The hepatitis C virus glycan shield and evasion of the humoral immuneresponse. Viruses.2. 11，3:1909-1932 ; McCaffrey K,Boo I，Poumbourios P, Drummer HE. Expression and characterization of a minimal hepatitis C virus glycoprotein E2 core domain that retains CD81 binding.! Virol.2007,81:9584-9590)。HCV包膜蛋白的高度变异性使得宿主难W形成 有效的保护性免疫，运是HCV逃逸机体免疫清除的机制之一，同时也是HCV疫苗W及中和 性抗体开发的主要难题之一。相对于高度变异的基因组W及E2上的高度变异区，E蛋白 上的糖基化修饰位点相当保守。在HCV的7个基因型和多个亚型之间，E2上分布的11 个糖基化位点中N5和N7(分别为75%和89% )W外的9个都是高度保守的（〉％97) (Goffard A,Dubuisson J. Glycosylation of hepatitis C virus envelope proteins. Biochimie. 2003, 85:295-301 ；Helle F, Goffard A, Morel V, Duverlie G,McKeating J,Keck ZY, Foung S,Penin F,Dubuisson J, Voisset C. The neutralizing activity of 曰nti-hep曰titis C virus曰ntibodies is modul曰ted by specific glyc曰ns on the E2 envelope protein. J Virol. 2007, 81:8101-8111)，运显示了 糖巧在HCV生活周期 中的重要作用。对运些聚糖的功能分析表明，糖巧的功能是多样的，且不同位置的糖基 化修饰功能是不完全相同的：（1)糖基化修饰影响蛋白质折叠，E2N8和E2N10缺失后直 接抑制E1E2蛋白的异二聚体的形成，E1N1，E2N3, E2N7, E2N8和E2N10突变导致病毒组 装缺陷影响病毒粒子的产量（Goffard A，Callens N，Bartosch B，Wychowski C, Cosset FL,Montpellier C,Dubuisson J.民ole of N-linked glycans in the functions of hepatitis C virus envelope glycoproteins. J Virol. 2005,79:8400-8409 ;Helle F,Vieyres G, Elkrief L,Popescu Cl, Wychowski C, Descamps V，Castelain S,民oingeard P, DuverlieG,DubuissonJ.民oleofN-linkedglycansinthefunctionsof hepatitisCvirusenvelopeproteinsincorporatedintoinfectiousvirions.J Virol, 2010, 84:11905-119巧）；（2)糖骨介导病毒粘附入侵细胞；E2N2和E2N4位糖基化位 点突变明显减少HCVpp对肝细胞的入侵感染；（3)糖骨保护病毒避免降解^及抗体的中和 作用，在HCV卵中的研究表明E2N2和E2N4缺失后假病毒更易被中和，而E2N1，E2N6和E2N11 缺失后导致HCVcc对中和性抗体更加敏感，因而这些位点糖骨的存在对于病毒抵抗中和抗 体的中和作用至关重要。从蛋白作为抗原的角度出发，糖巧可W遮蔽关键的抗原表位，使病 毒抗原表达时，机体不能有效识别病毒抗原，导致机体无法产生高效的抗病毒免疫保护反 应。在E2上哪个N-糖基化修饰去除能在体内诱导产生中和性抗体尚不清楚。
[0006] 尽管HCVE2上糖基化修饰位点是高度保守的，但在病毒感染后体内产生的抗 体的压力下，也还是会发生"糖巧移位"等现象来逃逸抗体的中和作用（Pan化aH，Diao J,UltschΜ,HazenΜ,MathieuΜ,McCutcheonΚ,TakedaΚ,DateS,CheungTK,Phung Q, HassP,ArnottD,KongoJA,MatthewsDJ,BrownA,PatelAH,KelleyRF,Eigenbrot C,KapadiaSB.GlycanshiftingonhepatitisCvirus(HCV)E2glycoprotein isamechanismforescapefrombroadlyneutralizingantibodies.JMol Biol, 2013, 425:1899-1914)，这种糖骨移位也不是随机的，有一个常见的现象是N1 (N417) 处的N突变为S/T，导致在M15处形成新的糖基化修饰位点，说明病毒会利用糖巧来遮蔽 这些表位从而避免抗体的中和化eckZY,AngusAGN,WangWY，LauP,WangY,Gatherer D,PatelAH,FoungSKH.Non-randomEscapePathwaysfromaBroadlyNeutralizing HumanMonoclonalAntibodyMaptoaHighlyConserved民egionontheHepatitisC VirusE2GlycoproteinEncompassingAminoAcids412-423.PLoSPath, 2014, 10)。
[0007] 由于原核表达的E2蛋白不能形成蛋白质的糖基化，得到的蛋白不能正确折叠，只 能提供线性表位，无法提供构象性表位，而真核表达的产量较化且纯化困难。DNA疫苗的 发展为一些难W体外表达的抗原提供了新的途径。DNAprime联合蛋白进行boost的方 式被认为是非常有效的免疫方式（SongMK,LeeSW，SuhYS,LeeKJ,SungYC.Enhancement ofimmunoglobulinG2aandcytotoxicT-lymphocyteresponsesbyabooster immunizationwithrecombinanthepatitisCvirusE2proteininE2DNA-primed mice.JVirol, 2000, 74:2920-2925)。目前，关于DM疫苗的机理仍不是特别清楚，运种 方便的免疫途径至少可W将表达质粒导入体内，在细胞中表达后提供胞内抗原，加工后被 I类分子递呈，如果是分泌型蛋白还可提供胞外抗原，被循环的或定居在组织中的抗 原递呈细胞加工后