一种鱼类血清淀粉样p成分及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类（半滑舌錦）血清淀粉样P成 分及其应用。
【背景技术】 |；0002] 血清淀粉样P成分（SerumamyloidPcomponent,SAP)，属于正五聚蛋白 (Pentraxins，PTX)家族，是一个典型的胞外分泌型急性反应期蛋白，分子量约为25. 2kDa， 含有一个PTX结构域区。在哺乳动物非特异性免疫中SAP发挥作用，其配体种类多样；SAP 能结合细菌表面的脂多糖、憐酸乙醇氨和多糖，也能结合DM、组蛋白、染色质和小核糖核 酸蛋白，被认为在识别损伤细胞及其胞内组分和清除调亡及坏死细胞的过程中发挥重要作 用。另外，SAP可与Clq相互作用而激活补体经典途径，进而调节炎症反应和调理作用。因 此，SAP是非特异性免疫反应中一种重要的体液模式识别分子。目前有关鱼类SAP的研究 很少，其功能几乎完全未知。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于提供一种鱼类（半滑舌錦）血清淀粉样P成分及其应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 阳0化]一种鱼类血清淀粉样P成分重组蛋白，鱼类（半滑舌錦）血清淀粉样P成分重组蛋 白W半滑舌錦cDNA为模板，用引物SapFl和SapRl进行PCR扩增血清淀粉样P成分基因， 扩增产物经诱导表达、纯化即为半滑舌錦血清淀粉样P成分重组蛋白，所述SapFl为5'-GA TATCATGGTAACACAAGATCTCTCAGGAAA-3,；SapRl为 5, -GATATCCATATCATCTGGTGCATCATC-3，。
[0006] 所述半滑舌錦血清淀粉样P成分重组蛋白在与细菌特异性结合中的应用。
[0007] 所述半滑舌錦的血清淀粉样P成分重组蛋白可应用于制备抑制细菌或病毒感染 的制剂。
[0008] 所述抗感染的细菌为巧光假单胞菌，病毒为细胞肿大病毒。
[0009] 本发明具有如下优点：本发明的血清淀粉样P成分能够结合多种细菌，并且能够 显著提高鱼类的抗细菌和抗病毒能力。
【附图说明】
[0010] 图1为本发明实施例提供的纯化的血清淀粉样P成分蛋白电泳图。泳道1，分子量 标准；泳道2,血清淀粉样P成分。
[0011] 图2为本发明实施例提供的血清淀粉样P成分蛋白与各种细菌的结合能力检测结 果。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非w任何形式对本发明进行限制。
[0013] 在本发明实施例中所设及到的常规性实验方法均采用如下方法：
[0014] 1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用"天根生化科技 (北京）有限公司"的相应试剂盒。
[0015] 2.大肠杆菌用Han址an方法（SambrookandRussell:MolecularCloning:A L曰bor曰toryM曰nniml.ColdSpringH曰rborL曰bor曰toryPress2001)〇
[0016] 3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"纽英伦生物技术有限公司"，北京。
[0017] 实施例1
[0018] 血清淀粉样P成分重组蛋白的制备 阳019] 1)表达血清淀粉样P成分重组蛋白的质粒pCsSap的构建：
[0020] 本发明的血清淀粉样P成分氨基酸序列已公布（GenBankaccessionnumber KT02585巧：
[0021] MMEKLFLFTALMISTCCAVTQDLSGKVFVFPKETNTDHVKLLTTRSTFYNVTVCLRFLTDLNRAYSLFS MSTPTVENA化lYGEPANHVLHVYSGSGPTFHAVP巧QNTW服LCSTWG服SGVAQIWLNGKPYVKKFVTNQPIGGK PISILG犯QDSYGGG抑AAQSFVGMISDVHMWDQVLTPTEIKSYMNHRHVTPGNVFNWR化QYEITGLVLV孤APD DM
[0022] 血清淀粉样P成分由224个氨基酸组成，含有一个PTX结构域，由21-218氨基酸 残基组成。W半滑舌錦cDNA为模板，用引物SapFl和SapRl进行PCR扩增血清淀粉样P成 分基因。PCR条件为：94°C60s预变性模板DNA，然后 94°C40s，58°C60s，72°C60s，30 个循环后再在72°C延伸反应7-lOmin。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体 pET259(构建过程参见HuYH,ZhengWW,SunL.Identificationandmolecularanalysis ofaferritinsubunitfromreddrum(Sciaenopsocellatus).FishShellfishImmunol 2010 :28:678 - 86)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收5. 3化片段，将其与上述纯化的PCR 产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌D册α，在含卡那霉素（lOOug/ml)的LB 培养基上培养18 - 24小时，筛选转化子提取质粒，命名为pCsSap。通过DM测序分析证 明了pCsSap为含有上述PTX结构域的血清淀粉样P成分序列的表达质粒，其中，pCsSap质 粒中血清淀粉样P成分序列与GenBankaccession公开的numberKT025856序列一致。
[0023] 所述LB组成成分按重量百分比计：1.0%蛋白腺，0.5%酵母粉，1.0%氯化 钢，97.5%蒸馈水。所述8日9。1为5，-64了41^4了66了44〔4〔44641'(：1'(：1^406444-3，；5日91?1为 5' -GATATCCATATCATCTGGTGCATCATC-3'。
[0024] 2)血清淀粉样P成分重组蛋白的诱导表达和纯化
[00巧]将上述的质粒pCsSap用常规方法转化大肠杆菌化21 0E3)(购自于"天根生化科 技有限公司"，北京），在含有卡那霉素巧Oug/ml)的LB固体培养基上培养18-24小时，挑 取转化子，将其命名为化21/pCsSap。将化21/pCsSap于含有卡那霉素巧Oug/ml)的LB液 体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液，加入100ml新鲜的含有卡那霉素巧Oug/ml) 的LB液体培养基中，于37 °C下转速20化pm摇动培养至ODe。。为0. 6,加入终浓度为0. 4mM的 IPTG，28°C继续W转速160巧m摇动培养化，而后W5000g，4°C离屯、lOmin，收集菌液，加入 5ml裂解液，在室溫于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液WlOOOOg， 4°C离屯、30min，回收上清。将上清中的蛋白用亲和层析柱化STrapHPColumns(购于美国 GEHealthcare公司）回收纯化。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测（8v/cm电压下电泳 25 - 30min，随后15v/cm电压下电泳2 - 2.化），测定其分子量大小（参见图1)。发现它 的蛋白质质量与血清淀粉样P成分相同。将此纯化的蛋白命名为rCsSAP。
[0026] 所述裂解液为终浓度的lOmM胞&?〇4、lOmM Tris和8M尿素，P册.0。
[0027] 实施例2
[0028] 血清淀粉样P成分的应用-血清淀粉样P成分与细菌的相互作用
[0029] 1)细菌悬液制备。在LB培养基中分别培养革兰氏阴性细菌巧光假单胞菌 (Pseudomonasfluorescens)(保存于CGMCC，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中屯、；保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2008 年1月9日，编号为CGMCCNo. 2329)、迟缓爱德华氏菌巧dwardsiellatarda)(保存于 CGMCC，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、；保藏单位地址为北京市朝阳区大 屯路，中国