橡胶树死皮相关蛋白HbMC1及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域中橡胶树死皮相关蛋白化MCI及其编码基因W及二者 在调控细胞死亡、氧化胁迫抗性及橡胶树死皮发生中的应用。
【背景技术】
[0002] 己西橡胶树化eveabrasiliensisMuell.Arg.)因具有橡胶含量高、质量好、经 济寿命长、易采收等独特优点而成为天然橡胶的主要来源。我国是世界第一大天然橡胶消 费国，年消费量高达370万吨。由于我国属于非传统植胶区，植胶区域有限，我国年产胶量 不到80万吨，自给率不足22%。在植胶±地面积有限的情况下，要保障天然橡胶供给能 力，就必须大幅提高单位面积的橡胶产量。在影响单产的因素中，死皮是主要限制性因子 之一。目前，世界各植胶国胶园死皮率在20%~50%之间，年产量损失高达15%~20% (Venkatachalam等，2010)。鉴于死皮对天然橡胶产业的严重影响，提高单产必须解决死皮 问题，而阐明死皮发生机制是解决死皮问题的前提，开展橡胶树死皮发生机制及防控研究 具有重要的理论和应用价值。
[0003] 己西橡胶树的树皮是由维管形成层向外分化形成的，具有初皮射线、初皮薄壁细 胞、筛管、伴胞、初皮纤维等基本组织的结构。作为最主要的产胶植物，橡胶树的树皮具有一 种特化的产胶组织一乳管。在天然橡胶生产中，人们通过切割橡胶树树皮中的乳管，收集由 割线排出的胶乳，作为提炼天然橡胶的原料。橡胶树死皮（TappingPanel化yness，TPD) 的症状为割线排胶减少或完全停排。割胶对橡胶树来说是一种不可避免的机械伤害。橡胶 树死皮的成因十分复杂，它既可W自发产生，也可W通过各种内外因素诱导产生，割胶强度 过大、长期和过度使用乙締利刺激排胶会导致橡胶树死皮的发生，研究发现死皮橡胶树中 活性氧水平升高。研究者曾从病理、生理、遗传、±壤和生化等方面进行了探索与研究，但其 发生机制仍不清楚。目前，死皮被认为是一种由过度割胶和强乙締刺激引起的、复杂的生理 综合症（范思伟和杨少琼，1995)。近年来，随着分子生物学和相关基因工程技术在橡胶树 生理生化研究中的应用，对橡胶树死皮发生机制的研究取得了初步进展，推测活性氧代谢、 泛素-蛋白酶体途径、细胞程序化死亡（ProgramedCellDeath,PCD)、莱莉酸生物合成及 橡胶生物合成途径等基因表达改变与橡胶树死皮发生有关。化en等（2003)在橡胶树树皮 中鉴定并克隆死皮相关基因化Mybl，该基因可能是细胞程序化死亡的负调控因子，并提出 "橡胶树死皮是一种细胞程序化死亡现象"的观点。化ng等（2011)进一步研究表明：与健 康橡胶树相比，死皮橡胶树乳管细胞具有细胞程序化死亡的典型特征，在烟草中超量表达 HbMybl可抑制逆境诱导的细胞死亡。Venkatachalam等（2007)、Li等（2010 ;2012)和覃碧 等（2012)利用抑制性差减杂交及基因忍片技术对死皮和健康橡胶树胶乳或树皮间基因表 达差异进行分析，发现大量与细胞程序化死亡途径相关的基因在二者之间差异表达，证明 细胞程序化死亡在橡胶树死皮发生过程中扮演重要角色。研究细胞程序化死亡途径中重要 基因在橡胶树死皮发生中的作用将有助于死皮发生的分子机制的解析，并能为橡胶树死皮 防控提供重要的祀标基因。 W〇4] 在动物细胞程序化死亡过程中，半脫天冬蛋白酶（cysteine-dependent aspartate-specificproteases,caspase)起着关键作用（XamandZhang, 2012)。研究 显示，有些植物能够产生类似caspase活性的物质，并且运种酶活性调控着细胞程序化死 亡过程。尽管如此，在植物中并没有找到与caspase同源的蛋白质，但是发现有一类含 有caspase结构域kaspasedomain)的类半脫天冬蛋白kaspase-Ukeprotein),称为 metacaspase(MC)。Metacaspases存在于蓝藻、真菌、酵母和高等植物中（Jiang等，2010)。 根据caspase-like功能区的序列相似性和序列结构，metacaspases可W分成2种类型，即 I型和II型扣ren等，2000)。除均含有与caspase大亚基相似的约150个氨基酸的保守 区域及在C末端存在的与caspase小亚基相似的第二保守区域外，来自植物和真菌的I型 metacaspase蛋白N端的prodomain含有1个特定的氨基酸模体（motif,通常是富含脯氨酸 的重复模体（proline-richr巧eatmotif)或者锋指模体（zincfingermotif)。运一锋指 结构与植物超敏反应相关的蛋白LSD-1相似。植物中II型metacaspase没有prodomain， 但是在p20和plO两个亚单位之间插入了一个长约200个氨基酸残基的片段（马聪和孔维 文，2012)。 阳0化]尽管metacaspase没有表现出类caspase活性，但它们仍然在植物细胞程序化死 亡过程中发挥作用（Zhang和Lam, 2011)。化eberichts等（2003)在灰葡萄抱菌引起的番茄 叶片超敏反应中观察到II型metacaspase基因LeMCAl表达量明显升高，说明metacaspase 参与了植物抗病的超敏反应。在烟草中，超量表达metacaspase基因NbMCl能增强烟草对 毁灭炭痘菌的抗性化ao等，2007)。欧洲云杉II型metacaspase的下调能抑制其胚胎形 成时期胚柄细胞的细胞程序化死亡过程（Suarez等，2004)。拟南芥基因组中共存在9个 metacaspase基因，其中，两个I型metacaspase基因（AtMCl和AtMC2)已被证实能调控细胞 程序化死亡过程，AtMCl是正调控因子，而AtMC2是负调控因子（Coll等，2010)。Watan油e 和Lam(2011)证明在生物和非生物胁迫诱导的拟南芥细胞程序化死亡中，AtMC4都发挥着 正调控因子的作用。小麦中该基因的同源基因TaMC4也被证实调控了条诱菌诱导的细胞程 序化死亡过程（Wang等，2012)。拟南芥II型metacaspase基因AtMC8在UVC和&〇2介导 的细胞程序化死亡过程中表达上调，该基因的缺失会减弱细胞死亡，推测AtMC8参与了氧 胁迫诱导的拟南芥细胞程序化死亡过程Ole等，2008)。Ahmad等（2012)也发现玉米II型 metacaspase基因的表达及活性受臭氧胁迫及衰老的诱导，metacaspase介导的蛋白质水 解在叶片应对臭氧胁迫及年龄诱导的衰老中起重要作用。拟南芥metacaspase基因AtMC9 则特异的在发育的木质部中表达，参与木质部细胞死亡调控度〇1化oner等，2013)。运些研 究结果表明，metacaspase基因家族成员在发育、生物或非生物逆境诱导的细胞程序化死亡 过程中发挥着关键作用。
[0006] 到目前为止，尚没有有关橡胶树metacaspase家族基因的研究报道。细胞程序化 死亡在橡胶树死皮发生中扮演重要角色，而metacaspase家族基因又在细胞程序化死亡中 起着重要调控作用。Metacaspase家族成员可能参与了橡胶树死皮发生调控。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是如何调控细胞的死亡，W及如何抑制或防治橡胶树 死皮。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与橡胶树死皮相关的蛋白质，其名 称为HbMCl,来源于大戟科橡胶树属的己西橡胶树化evea brasiliensis Muell.Arg.)，是 如下Al)或A2): 阳009] A1)氨基酸序列为序列表中序列1的蛋白质；
[0010] A2)在序列1的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸 残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质。 阳0川其中，序列1由367个氨基酸组成。
[0012] 为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端 或簇基末端连接上如表1所示的标签。 阳〇1引表1.标签的序列[0014]
阳0巧]上述A2)中的化MCI可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述A2)中的化MCI的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/ 或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0016] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与上述化MCI蛋白相关的生物材料，所述 生物材料为下述B1)至B12)中的任一种：
[0017] B1)编码化MCI的核酸分子；
[0018] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0019] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
[0020] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0021] B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
[0022] B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
[0023] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0024] B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
[00巧]B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0026] B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0027] B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0028] B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0029] 上述生物材料中，Bl)所述核酸分子可为如下bl)或b2)或b3)或b4)的基因：
[0030]bl)核巧酸序列是序列表中序列2的第23-1126位的cDNA分子或DNA分子； 阳03Ub2)核巧酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DM分子； 阳03引 与bl)或b。限定的核巧酸序列具有90%W上同一性，且编码化MCI的cDNA 分子或基因组DM分子；
[0033] b4)在严格条件下与bl)或b2)限定的核巧酸序列杂交，且编码化MCI的cDNA分 子或基因组DNA分子。
[0034] 其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也 可W是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0035] 其中，序列2由1160个核巧酸组成，第23-1126位为编码区，编码序列1所示的 HbMCl。
[0036] 本领域普通技术人员可W很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码化MCI的核巧酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分 离得到的编码化MCI的核巧酸序列90%或者更高同一性的核巧酸，只要编码化MCI且具有 化MCI功能，均是衍生于本发明的核巧酸序列并且等同于本发明的序列。
[0037] 运里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的编码化MCI所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核巧酸序列具有90%或更高，或95% 或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软 件，两个或多个序列之间的同一性可W用百分比（％)表示，其可W用来评价相关序列之间 的同一'性。
[0038] 上述严格条件是在2XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每 次5min，又于0. 5XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次15min;或， 0. 1XSS阳（或0. 1XSSC)、0. 1%SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0039] 上述90%W上同一性，可为90%或95%W上的同一性。
[0040] 上述生物材料中，B2)所述的含有编码化MCI的核酸分子的表达盒化bMCl基因 表达盒），是指能够在宿主细胞中表达化MCI的DNA，该DNA不但可包括启动化MCI基因 转录的启动子，还可包括终止化MCI基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增 强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异 的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花挪菜花叶病毒的组成型启动 子35S;来自番茄的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肤酶广LAP",化ao等人（1999)Plant Physiol120:979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关l(PRl)(由水杨酸 和BTH(苯并嚷二挫-7-硫代径酸S-甲醋）诱导）；番茄蛋白酶抑制剂II启动子（PIN2) 或LAP启动子（均可用莱莉酬酸甲醋诱导）；热休克启动子（美国专利5,187,267);四环 素诱导型启动子（美国专利5,057, 422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子 PF128 (CN101063139B(中国专利200710099169. 7))，种子胆存蛋白质特异的启动子（例如， 菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子度eachy等人（1985化MB0 J.4 :3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参 考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌姻脂碱合成酶终止子（N0S 终止子）、花挪菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、魏豆rbcSE9终止子和姻脂氨酸 和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Od