用于fret的新化合物及与其相关的方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及用于分子内荧光共振能量转移（FRET)的化合物及与其相关的方法、试剂盒和组合物，所述化合物包含基于碳代NADH(carbaNADH)的第一荧光团的氧化形式和可在约445至约540nm的波长激发且最大发射大于约560nm的第二焚光团。【
背景技术：
】[0002]许多生物分析方法基于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)的氧化状态。NAD具有多个环形结构，其经历了烟酰胺环内的氧化还原反应。密切相关的NADP分子是在腺苷核糖环的2'位上磷酸化的。[0003]NAD和NADP可通过正式加入氢负离子可逆地还原，并且这两种分子在可逆反应中作为辅酶起作用。因此，基于NAD和NADH的酶反应适于进行荧光分析。[0004]许多氧化还原酶可使用这些辅因子在分子之间转移氢基团。因为这些分子的还原形式在其吸收光的能力上不同于它们的氧化形式，所以基于在340nm的光吸收或通过在445nm光的荧光发射已经定量反应。[0005]酶的脱氢酶反应可采用如下特性：NAD和NADP的还原形式吸收波长为340nm的光，而氧化形式则不能。类似地，当在340nm激发时，还原形式能够在445nm发射焚光，而氧化形式则不能。这些特性使得定量直接涉及这些辅因子的氧化状态变化的反应成为可能。例如，当在三磷酸腺苷（ATP)存在下，将磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶用于催化由NADH形成NAD时，三磷酸腺苷的浓度可以荧光强度降低进行测量（美国专利4,446,231和4,735,897)。[0006]氧化还原酶在血糖水平的定量测量中也相当普及，参见例如EP0293732A2、US2005/0214891A1和US2006/0003397。所有这些公开均描述了用于测量葡萄糖的类似的测试方案，其中使用含有酶-辅酶对葡萄糖脱氢酶（GlucDH)/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)的试剂系统。GlucDH起作用后，氢负离子从葡萄糖转移至NAD，从而形成NADH。所得NADH的量与葡萄糖的浓度直接相关。NADH为强荧光团，其浓度可以通过测量荧光强度来测定。样品中的分析物浓度通常是通过使测量的荧光强度与用已知分析物浓度得到的校正曲线相关联来确定。[0007]显然，基于酶的测量系统用于生化分析是临床相关分析方法的重要组成部分。这主要是涉及分析物（例如代谢物或底物）的测量，其直接或间接借助酶进行测定。借助酶-辅酶复合物将分析物转化并随后进行定量。在该过程中，待测定的分析物与合适的酶和辅酶接触，其中酶通常以催化量使用。辅酶是变化的，例如通过酶反应进行氧化或还原。该过程可例如光度测定进行检测。校正提供测量值与待测定的分析物浓度之间的直接关联。[0008]辅酶是与酶共价或非共价结合且通过转化分析物而变化的有机分子。辅酶的突出实例是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)，由此通过还原分别形成NADH和NADPH。[0009]现有技术已知的许多基于氧化还原酶的测量系统具有有限的保质期且需要谨慎处理，诸如冷却或干燥贮存，以达到足够的贮存寿命。因此，可发生不正确、未察觉的贮存不良引起的结果。特别是由基本包装开口和长时间使用周期引起的干燥剂的耗竭可导致测量误差。[0010]上述基于酶的测量系统的基本组成部分，即酶和辅酶，均可独立地有助于这种有限的稳定性。例如，已知辅酶诸如NAD和NADP相当不稳定。[0011]NAD和NADP是文献中描述的降解途径的碱不稳定性分子（参见例如N.J.OppenheimerinThePyridineNucleotideCoenzymesAcademicPress,NewYork,London1982,J.Everese,B.Anderson,K.Yon,Editors,chapter3,pages56_65)〇ADP-核糖基本上是在通过裂解核糖和吡啶单元之间的糖基键而降解NAD或NADP过程中形成的。NADH和NADPH的还原形式是酸不稳定的；例如差向异构化是已知的降解途径。[0012]NAD/NADP和NADH/NADPH的不稳定性是由于核糖和吡啶单元之间的糖基键的不稳定性。但是，即使在不激烈的条件下诸如在水溶液中，辅酶NAD和NADP可能仅仅由于环境湿度就已经被水解。[0013]碳代NAD类似于NAD，其中核糖被碳环糖单元替代。碳代NAD(或碳-NAD)具有下列结构（I):[00141123456然而，即使当使用更稳定的辅酶碳代NAD时，仍有一系列相当根本的问题与荧光强度的测量有关，其包括以下：2基于荧光强度测量的测量误差的一个重要来源来自非特异性光，其到达来自环境的探测器且可引起非特异性信号。3所测量的荧光的强度不仅仅是荧光团的量的函数。相反，它也明显受其样品中分子环境的影响。具体而言，在术语荧光猝灭下概述的方法导致测量误差。4分子的位置和定位可在吸收与发射之间变化，因为在统计学方法中呈纳秒量级的时间在分子的激发和光量子的发射之间经过。由此导致的干扰影响涉及荧光强度，具体为温度依赖性。5荧光一般由紫外线激发。电子激发态的光化学反应可引起荧光团的漂白。这是另一个误差源。6在此基础上，本发明的一个目的是提出一种方法，其允许具体涉及所述稳定性问题、测量误差和干扰的改进的测量。【
发明内容】[0021]本发明涉及一种化合物，其包含[0022](1)基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式，和[0023](2)可用波长为445至540nm的光激发且最大发射大于560nm的第二焚光团，[0024]具体地其中基于碳代NADH的第一荧光团和第二荧光团共价连接。[0025]在另一个实施方案中，本发明涉及用于测定样品中分析物浓度或量的基于荧光的方法。【具体实施方式】[0026]本发明涉及一种化合物，其包含[0027](1)基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式，和[0028](2)可用波长为445至540nm的光激发且最大发射大于560nm的第二焚光团，[0029]具体地其中基于碳代NADH的第一荧光团和第二荧光团共价连接。[0030]本发明化合物具体用于分子内荧光共振能量转移（FRET)方法，例如，如本说明书中详述的方法。[0031]在优选的实施方案中，第二荧光团的最大发射为560至750nm。[0032]在另一个优选实施方案中，第二荧光团可用波长为445至475nm的光激发。[0033]基于碳代NADH的第一焚光团优选可用波长为300至400nm，优选360至380nm，更优选365至385nm，最优选370至380nm的光激发。[0034]碳代NADH最大可用波长为360nm的光激发。[0035]碳代NADH的最大发射为465nm。[0036]使用这种用于FRET的化合物克服了基于荧光的方法中NAD衍生的化合物的上述缺陷。如实施例中所述，化合物N6-[N-(6-"Cy3"氨基己基）氨甲酰基甲基]碳代NADH被证明可用于FRET方法。"Cy3"定义如图2所示的一类化合物并且也被称为2-[3-[1-(己-5-酰基）-1，3-二氢-3,3-二甲基-5-硫代-2H-吲哚-2-亚基]-1-丙烯-1-基]-3,3-二甲基-5-硫代-1-(3-磺基苯基）-3H-吲哚鑰实体，其中己酰基的羰基与氨基己基的氨基连接）。[0037]术语"基于碳代NADH的第一荧光团"仅用于指基于在400至570nm发荧光的碳代NAD/碳代NADH氧化还原系统的化合物的还原形式。酶底物通常是呈其氧化形式（碳代NAD)(也称为基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式）的本发明化合物或荧光辅酶。[0038]本发明化合物包含碳代NAD部分，并且由此分别包含烟酰胺实体和腺苷实体。烟酰胺实体可被还原成1，4-二氢烟酰胺实体，其作为荧光团起作用。烟酰胺实体通常是未取代的。腺苷实体的其余原子可为经取代的。对本领域技术人员显而易见的是，这种取代必须与感兴趣的酶反应相容。这种取代列于Thepyridinenucleotidecoenzymes·NewYork,N.Y:AcademicPressInc.；1982.Chapter4:B.M.AndersonAnalogsofPyridineNucleotideCoenzmespp.91-134中。优选的取代基为腺苷酸实体中2'OH上的磷酸酯基团，形成碳代NADP部分。取代基优选在腺苷酸核碱基上（Thepyridinenucleotidecoenzymes.NewYork,N.Y:AcademicPressInc.；1982.Chapter4:B.M.AndersonAnalogsofPyridineNucleotideCoenzmespp.103_104tableIItemIIA)。取代的最优选位置为腺苷酸核碱基的N6和C8。N6和C8处的合适取代基独立地为(^至C12烷基、烯基或炔基(alkinyl)，其任选地被一个或多个0、N和/或S原子中断，并且其中所述(^至C12烷基、烯基或炔基任选地取代有=〇、-OH、-SH、=S或(^至C4烷基，所述烷基任选地被一个或多个〇、N或S原子取代或中断，并且其中N6或C8中的一个优选经长度为25个原子或更少的连接基分子与第二荧光团连接。将基于碳代NAD的部分理解为碳代NAD部分，其如上文所定义任选取代。[0039]碳代NADH的氧化形式，即碳代NAD，具有上述式（I)的结构。[0040]在一个优选的实施方案中，基于碳代NADH的第一荧光团的氧化形式为具有式II的基于碳代NADH的第一荧光团[0041][0042]其中[0043]Q为冊况，其中&和R2独立地选自H、C連C12烷基、C連C12烯基和C連C12炔基，任选地其中烷基、烯基和炔基的一个或多个碳原子用0、N或S代替，和/或[0044]任选地其中所述(^至C12烷基、烯基和炔基取代有=0、-0H、-SH、=S或C1至C4烷基，其中烷基的一个或多个碳原子任选地用〇、N或S代替，且[0045]J选自烷基、(^至(：12烯基和(^至(：12炔基，任选地其中烷基、烯基和炔基的一个或多个碳原子用〇、N或S代替和/或任选地其中所述(^至C12烷基、烯基和炔基取代有=〇、-OH、-SH、=S或(^至C4烷基，其中烷基的一个或多个碳原子任选地用0、N或S代替，具体地其中J和Q中的一个经由长度为25个原子或更少的连接基分子与第二荧光团连接，且[0046]T为氢原子或磷酸酯基团，尤其当前第1页1 2 3 4