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【专利说明】细胞外的二萜生产 发明领域
[0001] 本发明涉及使用重组微生物生产二萜和/或糖基化二萜的方法。本发明还涉及一 种发酵液，其中所述发酵液包括通过这种方法可获得的二萜和/或糖基化二萜。
[0002] 发明背景
[0003] 世界各地对高效甜味剂的需求不断增长，而且混合不同的人工甜味剂正在逐渐变 成一种常规做法。然而，对甜味剂替代品的需求预计将会增加。多年生草本植物一甜叶菊 (SteviarebaudianaBert.)一的叶子中积聚了大量极甜的化合物，它们被称为甜菊糖苷。 虽然这些化合物的生物学功能还不明确，但由于甜叶菊甜味剂是天然植物产品这一附加优 势，它们作为备选的高效甜味剂具有商业意义。
[0004] 这些甜的甜菊糖苷显示出优于许多高强度甜味剂的功能特性和感官性状。此外， 研究表明甜菊苷（stevioside)能降低II型糖尿病人的血糖水平和中度高血压患者的血 压。
[0005] 甜菊糖苷积聚于甜菊叶中，它们可以占甜菊叶干重的5-20%。甜菊苷和莱苞迪苷 (rebaudioside)A都具有热稳定性和pH稳定性，因此适合用于饮料和许多其它食物中。甜 菊苷比蔗糖甜110-270倍，莱苞迪苷A比蔗糖甜150-320倍。此外，具有更好味道的莱苞迪 苷D也是积聚于甜菊叶的高效二萜糖苷甜味剂，它可能比蔗糖甜约200倍。
[0006] 目前，甜菊糖苷是从甜菊植物中提取的。在甜菊中，（-)_贝壳杉稀酸（kaurenoic acid，赤霉素（GA)生物合成的中间物）被转换为四环的二萜一甜菊醇，然后甜菊醇继续通 过多步骤的葡糖基化途径形成各种甜菊糖苷。然而，产率是可变的并受农业和环境条件的 影响。而且，种植甜菊需要大量陆地面积、收获前的长久时间、密集的劳动力以及提取和纯 化糖苷的额外费用。
[0007] 为了满足对高效、天然甜味剂日益增长的商业需求，需要新的、更标准的、完全单 一成分的、没有后味的糖苷来源。
[0008] 发明概沐
[0009] 在甜菊中，通过脱氧木酮糖磷酸酯途径（deoxyxylulose5-phosphatepathway) 形成香叶基香叶基焦磷酸（GGPP)，甜菊醇就是从GGPP合成的。（-)-柯巴基二磷酸合酶 (copalyldiphosphatesynthase,CPS)和卜）-贝壳杉烯?合酶（kaurenesynthase,KS)这 两个二萜环化酶的活性导致（-)_贝壳杉烯的形成，然后在一个三步骤的反应中，（-)-贝壳 杉稀被贝壳杉稀氧化酶（kaureneoxidase，K0)氧化形成（-)-贝壳杉稀酸。
[0010] 在甜菊叶中，（-)_贝壳杉烯酸接着被内根-贝壳杉烯酸13-羟化酶（KAH)羟基化 以形成甜菊醇。然后，甜菊醇被一系列UDP-葡糖基转移酶（UGTs)葡糖基化。
[0011] 本发明涉及使用微生物在细胞外生产二萜或糖基化二萜的方法，所述微生物能够 产生二萜（例如甜菊醇）或糖基化二萜（即二萜糖苷，例如甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊 苷、莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、甜叶悬钩子苷 或杜克苷A)。
[0012]因此，根据本发明，提供了生产二萜或糖基化二萜的方法，所述方法包括：
[0013]a.在合适的发酵培养基中发酵重组微生物，
[0014] 其中所述微生物包含编码：具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；具有内 根-贝壳杉烯合酶活性的多肽；具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽；和具有贝壳杉烯 酸13-羟化酶活性的多肽的一个或多个核苷酸序列，并且其中所述核苷酸序列的表达赋予 所述微生物生产至少甜菊醇的能力，
[0015] 其中二萜或糖基化二萜被排出/分泌/转运到所述细胞之外并且在发酵培养基中 在细胞外生产；及
[0016]b.从所述发酵培养基回收所述二萜或糖基化二萜。
[0017] 换言之，本发明的方法是细胞外的二萜或糖基化二萜生产方法。二萜或糖基化二 萜由生产宿主微生物排出到发酵培养基中，然后从发酵培养基中物理和/或化学回收。因 此，二萜或糖基化二萜的回收被简化，并且其与需要从部分或完全在细胞内生成并积累甜 菊醇糖苷的重组微生物本身回收这些化合物的方法相比在经济上可行。
[0018] 在本发明的方法中，重组微生物可包含编码具有UDP-葡糖基转移酶活性（UGT)的 一个或多个多肽的一个或多个核苷酸序列，
[0019] 其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊 苷、莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、甜叶悬钩子苷 或杜克苷A中的至少一种的能力。
[0020] 根据本发明，还提供了：
[0021] -包含通过本发明的方法能够获得的二萜或糖基化二萜的发酵液；
[0022] -通过本发明的方法获得的或从本发明的发酵液能够获得的二萜或糖基化二萜；
[0023]-包含本发明的二萜或糖基化二萜的食品、饲料或饮料；和
[0024]-以上所定义的重组微生物在细胞外生产二萜或糖基化二萜的用途。
[0025] 附图简沐
[0026] 图1展示了质粒pUG7_EcoRV的示意图。
[0027] 图2展示了设计ERG20、tHMGl和BTS1过表达盒（A)，并将其整合至酵母基因组（B) 的方法的示意图。（C)显示了利用Cre重组酶移除KANMX标记后的最终状态。
[0028] 图3展示了ERG9敲低构建体的示意图。所述构建体由500bpERG9的3'部分、 98bpTRP1的启动子、TRP1的开放阅读框和终止子以及之后的400bp长的ERG9的下游序列 组成。由于在ERG9的开放阅读框的终点引入了Xbal位点，因此最后的氨基酸变成了丝氨 酸，终止密码子变成了精氨酸。新的终止密码子位于TRP1的启动子中，这导致延长了 18个 氨基酸。
[0029] 图4展示了将UGT2整合至基因组的示意图。A.转化中使用的不同片段；B.整合 后的状态；C.Cre重组酶表达后的状态。
[0030] 图5展示了将GGPP到RebA的途径整合至基因组的示意图。A.转化中使用的不同 片段；B.整合后的状态。
[0031] 图6展示了质粒MB6754的示意图。
[0032] 图7展示了质粒MB6761的示意图。
[0033] 图8展示了质粒MB6762的示意图。
[0034] 图9展示了质粒MB6775的示意图。
[0035] 图10展示了生物合成甜菊糖苷的潜在途径的示意图。
[0036] 图11展示了从STV040去除UGT2基因的示意图。
[0037] 序列表说明
[0038] 表1展示了序列说明。本文描述的序列可以引用序列表或数据库访问号（同样展 示于表1)来定义。
[0039] 发明详沐
[0040] 在本说明书和附属的权利要求书的各个部分，词语"包括"、"包含"和"具有"及其 变形应被理解为包含性的。也就是说，在语境允许的情况下，这些词语意图传达的意思是： 可以包括其它没有明确列举的元素或整体。
[0041] 本文中不使用数量词修饰时指的是一个或多于一个（即一个或至少一个）对象。 例如，"要素"可能意味着一个要素或多于一个要素。
[0042] 我们已经证实本文所述的重组微生物能够生产二萜或糖基化二萜，优先在细胞外 生产所述二萜或糖基化二萜。因此，本发明涉及一种在细胞外生产二萜或糖基化二萜的方 法，所述方法包括使用重组微生物。本发明的方法通常为发酵方法，其中重组微生物在细胞 外生产二萜或糖基化二萜，即二萜或糖基化二萜被生产并被排出并且存在于发酵液中。可 直接从发酵液回收这种二萜或糖基化二萜，从而没有从重组微生物（细胞内）本身回收此 类化合物的昂贵必要性。所述方法中使用的重组微生物是能够生产二萜或糖基化二萜，通 常分别为甜菊醇或甜菊醇糖苷的重组微生物。
[0043] 产生和/或选择在细胞外生产甜菊醇糖苷的重组微生物相对于现有技术有特别 优势，例如i)产生经济上可行的产品，ii)产生更简单并且可调整规模的制备方法，iii)不 从细胞内材料（包括DNA和可影响产品感官性质的蛋白质）中纯化产品。需要强调的是，相 比于已知的生产方法，本发明的教导使得发酵性二萜如甜菊醇糖苷的生产成为商业现实。 特别地，重组微生物可为Yarrowia或Candida属的微生物。
[0044] 为了本发明的目的，二萜通常意味着由4个异戊二烯单元组成的有机物。这种化 合物可来源于香叶基香叶基焦磷酸。糖基化二萜或二萜糖苷是一种结合有糖的二萜，其 中糖通常与非碳水化合物部分相结合。通常，在二萜糖苷中，糖基通过其异头碳（anomric carbon)经由糖苷键与另外一个基团结合。优选的二萜和二萜糖苷分别是甜菊醇和甜菊糖 苷。因此，特别地，本发明涉及能够产生甜菊醇和甜菊糖苷的重组微生物。
[0045] 根据本发明，提供了一种在细胞外生产二萜或糖基化二萜的方法，所述方法包 括：
[0046]a.在合适的发酵培养基中发酵重组微生物，
[0047] 其中所述微生物包含编码：
[0048] 具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；
[0049] 具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽；
[0050] 具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽；和
[0051] 具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的一个或多个核苷酸序列，并且其中所述 核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少甜菊醇的能力，
[0052] 其中在所述发酵培养基中在细胞外生产二萜或糖基化二萜；以及
[0053] b.从所述发酵培养基回收所述二萜或糖基化二萜。
[0054] 用于本发明的重组微生物可为Yarrowia属之一，例如Yarrowialipolytica， 或Candida属之一，例如Candialipolytica。当重组微生物为Yarrowia例如Yarrowia lipolytica时，糖基化二踏可优先为莱茜迪苷A或莱茜迪苷D。用于本发明的重组微 生物可为Saccharomyces属之一，例如Saccharomycescerevisiae。当重组微生物为 Saccharomyces例如Saccharomycescerevisiae时，糖基化二踏可优先为甜叶悬钩子苷或 莱苞迪苷D。
[0055] 用于本发明的重组微生物包含编码：
[0056] 具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；
[0057] 具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽；
[0058] 具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽；和
[0059] 具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的一个或多个核苷酸序列，
[0060] 其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少甜菊醇的能力。
[0061] 为了本发明的目的，具有内根-柯巴基焦磷酸合酶（EC5. 5. 1. 13)活性的多肽能够 催化如下化学反应：
[0062]
[0063] 该酶有一种底物（香叶基香叶基焦磷酸）和一种产物（内根-柯巴基焦磷酸）。 该酶参与赤霉素的生物合成。该酶属于异构酶家族，具体是分子内的裂解酶类。这种酶类 的系统名称是内根-柯巴基-二磷酸裂解酶（去环化）。其它的常用名包括内根-柯巴基 焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶A和内根-贝壳杉烯合成酶A。
[0064] 为了本发明的目的，具有内根-贝壳杉烯合酶（EC4. 2. 3. 19)活性的多肽能够催化 下述化学反应：
[0065] 内根-柯巴基二磷酸#内根-贝壳杉烯+二磷酸盐
[0066] 因此，该酶有一种底物（内根-柯巴基二磷酸）和两种产物（内根-贝壳杉烯和 二磷酸盐）。
[0067] 该酶属于裂解酶家族，具体是作用于磷酸酯的碳-氧裂解酶。这种酶类的系统名 称是内根-柯巴基-二磷酸二磷酸酯-裂解酶（环化，形成内根-贝壳杉烯）。其它的常 用名包括内根-贝壳杉烯合酶B、内根-贝壳杉烯合成酶B、内根-柯巴基-二磷酸二磷酸 酯-裂解酶和（环化）。该酶参与二萜类化合物的生物合成。
[0068] 内根-柯巴基二磷酸合酶还可以有与同一蛋白质分子关联的不同的内根-贝壳杉 烯合酶的活性。内根-贝壳杉烯合酶催化的反应是赤霉素生物合成途径中的下一个步骤。 这两种类型的酶活性是不同的，抑制蛋白质的内根-贝壳杉烯合酶活性的定点突变导致内 根-柯巴基焦磷酸的积累。
[0069] 因此，本发明使用的单个核苷酸序列可编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性和 内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽。或者，可以用两段不同的、分开的核苷酸序列编码这两种 活性。
[0070] 为了本发明的目的，具有内根-贝壳杉烯氧化酶（EC1. 14. 13.78)活性的多肽能够 催化内根-贝壳杉烯的4-甲基的连续三次氧化以产生贝壳杉烯酸。这种活性通常需要细 胞色素P450的存在。
[0071] 为了本发明的目的，具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性（EC1. 14. 13)活性的多肽能 够催化利用NADPH和02形成甜菊醇（对映-贝壳杉-16-烯-13-醇-19-羧酸）的反应。 这种活性也可被称为内根-贝壳杉烯13-羟化酶活性。
[0072] 在本发明方法中使用的重组微生物可包括一种或多种核苷酸序列，其中所述核苷 酸序列编码具有UDP-葡糖基转移酶（UGT)活性的多肽，通过所述核苷酸序列的表达使重组 微生物能够生产甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷或莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱 苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、甜叶悬钩子苷、杜克苷A中的至少一种。
[0073] 为了本发明的目的，具有UGT活性的多肽具有糖基转移酶（EC2.4)活性，即作为 催化剂能够催化单糖基团从有活性的的核苷酸糖（又称"糖基供体"）转移至糖基受体分子 (通常是醇）。UGT的糖基供体通常是核苷酸糖尿苷二磷酸葡萄糖（尿嘧啶-二磷酸葡萄 糖，UDP-葡萄糖）。
[0074] 可以选择所使用的UGTs以产生期望的二踏糖苷，例如甜菊糖苷。Humphrey等 人，PlantMolecularBiology(2006)61:47_62 和Mohamed等人，J.PlantPhysiology 168(2011) 1136-1141中展示了甜菊糖苷形成的示意图。此外，图10展示了甜菊糖苷形成的 示意图。
[0075] 莱苞迪苷A的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化。具体而言，莱苞迪苷A 可通过以下步骤形成：首先葡糖基化甜菊醇的13-0H形成13-0-甜菊单糖苷，然后葡糖基化 甜菊单糖苷的13-0-葡萄糖的C-2'形成甜菊醇-1，2二糖苷，接着葡糖基化甜菊醇-1，2二 糖苷的C-19羟基形成甜菊糖苷，以及葡糖基化甜菊糖苷的C-13-0-葡萄糖的C-3'形成莱 苞迪苷A。各个葡糖基化反应发生的顺序可以变化一参见图10。如该示意图中所示，一种 UGT可以能够催化不止一种转换。
[0076] 通过在重组宿主中表达编码功能UGTs(UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1和UGT2)的基 因，可以实现从甜菊醇到莱苞迪苷A或莱苞迪苷D的转换。因此，当表达这四种UGTs的用 于本发明方法中的重组微生物产生甜菊醇或向培养基中补加甜菊醇时，该微生物能够制造 莱苞迪苷A。通常，这些基因中的一个或多个是重组基因，它们被转化到天生不具有这些基 因的微生物中。所有这些酶的实例都展示在表1中。本发明的微生物可能包括UGT74G1、 UGT85C2、UGT76G1和UGT2的任意组合。在表1中，序列UGT64G1被表示为序列UGT1，序列 UGT74G1被表示为序列UGT3,序列UGT76G1被表示为序列UGT4,序列UGT2被表示为序列 UGT2。
[0077] 适合用于本发明的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可 以包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的 多肽。也就是说，适合用于本发明方法中的微生物可包括能够催化将甜菊醇转换为甜菊单 糖苷的UGT。因此，这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生甜菊单糖苷。
[0078] 这种微生物可包括编码具有UDP-糖基转移酶（UGT)UGT85C2所显示的活性的多肽 的核苷酸序列，通过将所述核苷酸序列转化至微生物中，使细胞能够将甜菊醇转换为甜菊 单糖苷。
[0079]UGT85C2的活性是向甜菊醇的13-0H转移一个葡萄糖单元。因此，合适的UGT85C2 可以起尿嘧啶5' -二磷酸葡糖基：甜菊醇13-0H转移酶和尿嘧啶5' -二磷酸葡糖基：甜菊 醇-19-0-葡糖苷13-0H转移酶的作用。功能UGT85C2多肽还可以催化葡糖基转移酶反应， 该反应利用甜菊糖苷，而非甜菊醇和甜菊醇-19-0-葡糖苷作为底物。这种序列在表1中被 表示为序列UGT1。
[0080]用于本发明方法的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物还 可以包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊醇或甜菊单糖苷添加 C-13-葡萄糖的多肽。也就是说，合适的微生物可包括能够催化将甜菊单糖苷转换为甜菊双 糖苷的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷。这种核苷酸序列的表 达可以使重组微生物至少能产生甜菊双糖苷。
[0081] 适合用于本发明方法的微生物还可以包括编码具有UDP-糖基转移酶（UGT) UGT74G1所显示的活性的多肽的核苷酸序列，通过将所述核苷酸序列转化至微生物中，使细 胞能够将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷。
[0082] 适合用于本发明方法的微生物还可以包括编码具有UDP-糖基转移酶（UGT)UGT2 所显示的活性的多肽的核苷酸序列，通过将所述核苷酸序列转化至微生物中，使细胞能够 将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷。
[0083] 合适的UGT2多肽起着尿嘧啶5' -二磷酸葡糖基：甜菊醇-13-0-葡糖苷转移酶（也 被称为甜菊醇-13-单葡糖苷1，2-转葡糖基酶）的作用，它将葡萄糖部分转移至受体分子 (甜菊醇-13-0-葡糖苷）的13-0-葡萄糖的C-2'。通常，合适的UGT2多肽还起着尿嘧啶 5'-二磷酸葡糖基：甜叶悬钩子苷转移酶的作用，它将葡萄糖部分转移至受体分子（甜叶悬 钩子苷）的13-0-葡萄糖的C-2'。
[0084] 功能性UGT2多肽还可以催化利用甜菊糖苷，而非甜菊醇-13-0-葡糖苷和甜叶悬 钩子苷作为底物的反应，例如功能UGT2多肽可以利用甜菊苷作为底物，将葡萄糖部分转移 至19-0-葡萄糖残基的C-2'以产生莱苞迪苷E。功能UGT2多肽还可以利用莱苞迪苷A作 为底物，将葡萄糖部分转移至19-0-葡萄糖残基的C-2'以产生莱苞迪苷D。但是功能UGT2 多肽通常不能将葡萄糖部分转移至C-13位有1，3-键葡萄糖的甜菊醇化合物，即不能将葡 萄糖部分转移至甜菊醇1，3-二苷和1，3-甜菊苷。功能UGT2多肽还可以从不同于尿嘧啶二 磷酸葡萄糖的其他供体转移糖部分。例如，功能UGT2多肽可以起尿嘧啶5' -二磷酸D-木糖 基：甜菊醇-13-0-葡糖苷转移酶的作用，将木糖部分转移至受体分子（甜菊醇-13-0-葡糖 苷）的13-0-葡萄糖的C-2'。又例如，功能UGT2多肽能够起尿嘧啶5' -二磷酸L-鼠李糖 基：甜菊醇-13-0-葡糖苷转移酶的作用，将鼠李糖部分转移至受体分子（甜菊醇-13-0-葡 糖苷）的13-0-葡萄糖的C-2'。这种序列在表1中被表示为序列UGT2。
[0085] 适合用于本发明方法的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微 生物还可以包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊双糖苷添加 C-19-葡萄糖的多肽。也就是说，这样的微生物可包括能够催化将甜菊双糖苷转换为甜菊苷 的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊双糖苷转换为甜菊苷。这种核苷酸序列的表达可以使