一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物学领域，涉及一种蔗糖转化酶的测定方法，具体来说是一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法。
【背景技术】
[0002]在植物生理研究和教学过程中，需要进行特定器官或组织蛋白酶的测定。虽然蔗糖转化酶的测定方法已有不少报道，但组成植物与外界进行气体和水分交换的气孔的细胞，即保卫细胞的蔗糖转化酶活力仍然较难测定。
【发明内容】
[0003]针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法，所述的这种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法解决了现有技术中测定保卫细胞的蔗糖转化酶活力困难的技术问题。
[0004]本发明提供了一种测定生菜保卫细胞蔗糖转化酶活力的方法，包括如下步骤:
[0005]1) 一个制备生菜保卫细胞原生质体的步骤；所述的生菜保卫细胞的分离是通过酶解离法进行的；
[0006]2) 一个提取生菜保卫细胞原生质体蛋白质的步骤；将步骤1)获得的得到的生菜保卫细胞原生质体通过丙酮沉淀法提取；
[0007]3) 一个测定生菜保卫细胞原生质体蛋白质的步骤，所述的测定是通过考马斯亮蓝G-250法测定的；
[0008]4) 一个测定蔗糖转化酶活力的步骤；得到的保卫细胞通过酶联的方法测定酶化学反应的产物即葡萄糖含量，根据所产生的葡萄糖量、反应时间、保卫细胞的蛋白质含量计算蔗糖转化酶的活性，酶活力=葡萄糖(毫克)/[反应时间(小时)*保卫细胞总蛋白量(微克)]。
[0009]进一步的，步骤1)中采用的酶为纤维素酶。
[0010]进一步的，一个制备生菜保卫细胞原生质体的步骤如下:
[0011](1)取生菜叶片，然后放于蒸馏水中，在玻璃板上撕取表皮条，用毛笔刷除去叶肉细胞，将收集到的表皮条切碎后放入到基质溶液中冲洗；
[0012](2)过滤后放入到酶解液中，25?30°C水浴反应0.5?2h后，在显微镜下观察气孔开度，气孔开度呈饱满椭圆状时终止反应，过滤后用基本介质冲洗，再用重悬液悬浮表皮条，收集表皮条。
[0013]进一步的，所述的基质溶液由抗坏血酸、CaCl2、MgCl2、KH2P04、Mes和山梨醇组成，在所述的基质溶液中，所述的抗坏血酸的浓度为0.5mmol/L、CaClj^浓度为0.5mmol/L、]^012的浓度为0.5_31凡、1(!12?04的浓度为10 ymol/L、Mes的浓度为5mmol/L，山梨醇的浓度为540mM，PH为5?6。
[0014]进一步的，所述的酶解液由cellulysin、PVP-40、BSA、ΚΗ2Ρ04、抗坏血酸组成，在所述的第一酶解液中，cellulysin的质量百分比浓度为0.?%、PVP-40的质量体积比浓度为
0.1%, BSA的质量体积比浓度为0.25%、抗坏血酸的浓度为0.5mmol/L，使用时，在第一酶解液中加入基质溶液，所述的第一酶解液和基质溶液的体积比为55:45。
[0015]进一步的，所述的悬浮液由山梨醇、CaCl2、MgCl2、Mes组成，在所述的悬浮液中，山梨醇的浓度为0.54mol/L, 0&(:12的浓度为lmmol/L，MgCl 2的浓度为2mmol/L，Mes的浓度为5mmol/L，PH 为 5.5。
[0016]进一步的，一个提取生菜保卫细胞原生质体蛋白质的步骤如下:
[0017](1)将步骤1)获得的得到的生菜保卫细胞原生质体中加入提取缓冲液，所述的提取缓冲液由质量百分比浓度为1%的SDS、甘油、巯基乙醇、双蒸水组成，所述的SDS、甘油、巯基乙醇、双蒸水的体积比为1ml:2ml:1ml:16ml，摇勾并放在1?6°C条件下提取3?lOmin ；
[0018](2)放置后的样品充分摇匀，离心，上清液移入中加入2.5?3倍体积的预冷的丙酮-10?-30°C条件下过夜，之后，离心，弃上清，沉淀置于通风厨内使丙酮完全挥发，加入上样缓冲液溶解沉淀，沉淀充分溶解后，离心，取上清液即为所提取的叶蛋白溶液。
[0019]进一步的，一个测定蔗糖转化酶活力的步骤如下；
[0020](1)将原生质体悬浮混合液加入0.1M鹿糖开始反应，原生质体悬浮混合液和鹿糖溶液的体积比为1:9，25?35°C反应0.6?1.5h，80?90°C反应2?5min ;对照组是采用水替换原生质体悬浮混合液，在水中加入蔗糖，水和蔗糖溶液的体积比为1: 9，在85°C反应2 ?5min ；
[0021](2)将原生质体悬浮液组和对照组分别研磨，然后加入等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，离心后取上清；
[0022](3)再加入占上清液体积7?15%体积的1M Tris-HCl溶液进行反应；优选的为7.5%体积的1M Tris-HCl溶液；
[0023](4)再取上述溶液，加入2.5?3倍体积的缓冲液，所述的缓冲液由h印es-KOH、MgCl2、ATP、hexokinase、NADP、NADP-dependent G6P dehydrogenase，在所述的缓冲液中，hepes-KOH 的浓度为 100mM，MgCl2的浓度为 2.25mM、ATP 的浓度为 1.1Mm、hexokinase 的浓度为 0.2U、NADP 的浓度为 1.1mM、NADP-dependent G6P dehydrogenase 的浓度为 0.2U，反应一段时间后，测A34。。
[0024]蔗糖转化酶不可逆地催化蔗糖分解成果糖和葡萄糖，因此通过酶联方法测定单位时间内反应产物葡萄糖的生成量可测定蔗糖转化酶；由于保卫细胞含量较少，准确称取其鲜重比较困难，因此本发明采用测定其总蛋白质含量，以单位蛋白质的蔗糖转化酶活力来表示；此外，通过保卫细胞的制备及分离，使测定保卫细胞内蔗糖转化酶活力成为可能。
[0025]由于植物保卫细胞及其组成的气孔担负植物与外界交换气体(二氧化碳和氧气)和水分的责能，研究表明蔗糖转化酶活力与植物对干旱响应密切相关，因此保卫细胞内蔗糖转化酶活力测定特别是动态酶活测定对植物抗干旱研究及育种相当重要。
【具体实施方式】
[0026]下面对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0027]1.保卫细胞原生质体的制备
[0028]取生菜叶片，然后放于蒸馏水中，在玻璃板上撕取表皮条，用毛笔刷除去叶肉细胞，将收集到的表皮条切成0.5cm大小(尽量切小)放入到基质溶液中冲洗，过滤后放入到第一酶解液中，27.5°C水浴反应lh后，在显微镜下观察气孔开度，气孔开度呈饱满椭圆状时终止反应，过滤后用基本介质冲洗，再用重悬液200 μ L悬浮表皮条，收集表皮条于离心管中。
[0029]基本介质:
[0030]0.5mmol/L 抗坏血酸，0.5mmol/LCaC12，0.5mmol/LMgC12，10 μ mol/LKH2P04，5mmol/L Mes，540mM 山梨醇
[0031]PH5.5 (KOH)
[0032]酶解液:
[0033]0.7% cellulysin, 0.1% (ff/V)PVP-40,0.25% (ff/V)BSA,0.5mmol/L 抗坏血酸溶于45%的基本介质中
[0034]悬浮液:
[0035]0.54mol/L 山梨醇，lmmol/LCaC12，2mmol/LMgC12，5mmol/LMes，PH5.5 (KOH)
[0036]2.保卫细胞原生质体蛋白质提取及含量测定
[0037]得到的保卫细胞原生质体，加入4mL的提取缓冲液[lml 1% SDS,2ml