抗pd-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗pd-1单克隆抗体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗ro-i蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产 生的抗ro-i单克隆抗体和应用。
【背景技术】
[0002] 程序性细胞死亡因子1(processeddeath-1，PD_1)是由H)CD1基因编码的一个抑 制性共刺激分子，由288个氨基酸残基组成的50-55kDa的I型跨膜糖蛋白，由细胞外IgV 结构域、跨膜结构区域以及细胞内尾部结构三部分构成。它可表达于活化的T细胞、B细胞、 nk细胞等单核细胞及树突状细胞（DCs)表面，提示ro-i在免疫调节中扮演着更关键的角 色。ro-ι作为表达在活化τ细胞上的负性共刺激分子与肿瘤细胞表达的ro-Li结合，可抑 制T细胞增殖，并促进活化τ细胞的凋亡；而ro-i抗体则可以阻断ro-1/PD-Li的结合，使 效应T细胞发挥其肿瘤杀伤作用。
[0003] 近年来，大量的研究表明ro-i可以作为一种重要的分子标志物在各种肿瘤中的 预后诊断中发挥着重要的作用。在与ro-l相关的滤泡性淋巴瘤研究中，Wahlin等利用 组织芯片IHC的方法检测滤泡ro-i阳性细胞比例可以作为独立表征预后良好的判定依 据，但Takahashi等的研究认为ro-l并不能作为滤泡性淋巴瘤预后判读的有效指标， Richendollar等指出ro-l阳性T细胞比例越高，其病人的生存期越短，同样的研究也在霍 奇金淋巴瘤中有报道。在肝细胞癌中，Shi和Zeng等研究发现瘤内ro-1+T细胞高比例与 肝癌病人的无病生存期（dfs)呈反比，而外周微环境中的ro-i的表达水平可以作为独立判 定无治疗生存期（TFS)的预后指标。Thompson等研究发现肾细胞肿瘤病人中免疫细胞高表 达ro-ι蛋白与病人预后呈负相关。另有报道发现乳腺癌中浸润性淋巴组织中ro-i阳性细 胞数与组织学分级相关。在利用贝伐单抗（bevacizumab)、弗氧啼啶（fluorouracil)和伊 立替康（irinoteCan(F0LFIRI-B))治疗结直肠癌患者后，其外周血淋巴细胞中ro-l的过表 达与预后较差相关。
[0004] 目前在科研上通常通过流式细胞术（FlowCytometry，FC)检测Η)-1来标记和分 离干细胞和肿瘤干细胞，而临床上通常用免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC)病 理实验检测肿瘤组织内肿瘤干细胞中ro-i的表达状况。而不论是FC还是IHC，其实验方 法的核心为特异性结合ro-i的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度 和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对ro-ι蛋白的单克隆抗体具有重要的意 义。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供抗ro-i蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生 的抗ro-i单克隆抗体和应用，提高所述杂交瘤细胞产生的单抗与ro-i蛋白的结合特异性 并应用到相关广品的制备中。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] 抗ro-Ι蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCN0 :11085。
[0008] 本发明所述抗ro-i蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：
[0009] (1)重组表达载体的构建：根据PD-10RF核苷酸序列（PD-10RF核苷酸序列如 SEQIDNO. 1所示，864bp;ro-l氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示）设计引物进行PCR扩 增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点Sgfl和Mlul，插入表达载体pCMV6-Entry(货号 PS100001，Origene公司），构建PD-1 重组表达质粒RC210364 ;
[0010] (2)ro-l重组蛋白的表达与纯化：将ro-Ι重组表达质粒转化HEK293T，裂解离心取 上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的ro-i重组蛋白；
[0011] (3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的ro-i重组蛋白免疫BALB/c小鼠， 取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤 细胞，获得能分泌抗ro-Ι特异性抗体的杂交瘤细胞株；通过无血清培养基制备抗体，通过 亲和层析柱纯化获得ro-Ι单克隆抗体。通过免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和 特异性。
[0012] 经过上述方法制备后，筛选出能够稳定分泌抗ro-i单克隆抗体的杂交瘤细胞，命 名为UMAB199,亚型鉴定为IgG2a，并于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 保藏编号为CGMCCNO:11085。
[0013] 同时，本发明还提供一种抗Η)-1蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNO:11085 的杂交瘤细胞分泌产生。制备抗ro-Ι蛋白单克隆抗体可采用本技术领域常规方法，如通过 无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得ro-i单克隆抗体。
[0014] 本发明所述保藏编号为CGMCCNO:11085的杂交瘤细胞染色体稳定，其分泌产生 的抗Η)-1蛋白单克隆抗体为IgG2a型，效价较高。所述单克隆抗体的免疫组化检测结果显 示，其能够特异性识别肺癌淋巴细胞浸润组织、淋巴瘤组织、正常淋巴结和扁桃体组织中的 ro-i蛋白。
[0015] 同时，采用OriGene高密度蛋白芯片检测所述单抗的特异性试验表明，本发明所 述单克隆抗体仅和ro-i蛋白特异性结合，而与近loooo种其他蛋白无交叉反应。
[0016] 因此，本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO:11085的的杂交瘤细胞在制备抗 ro-Ι蛋白单克隆抗体中的应用以及所分泌的抗ro-i蛋白单克隆抗体在制备检测ro-i蛋白 的免疫检测产品中的应用。
[0017] 作为优选，所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。
[0018] 本发明还提供一种免疫组化检测的试剂盒，包括保藏编号为CGMCCNO:11085的 杂交瘤细胞分泌产生的抗ro-Ι蛋白单克隆抗体。所述免疫检测试剂盒可检测肿瘤组织及 其微环境中ro-Ι的表达状况。
[0019] 此外，本发明还提供保藏编号为CGMCCNO:11085的杂交瘤细胞分泌产生的抗 ro-Ι蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤组织及其微环境中淋巴细胞的试剂盒中的应用。
[0020] 作为优选，所述肿瘤包括结肠癌、淋巴瘤、肺癌、肝癌，肾癌和乳腺癌。
[0021] 作为优选，所述淋巴瘤包括滤泡性淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
[0022] 本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗ro-i蛋白单克隆抗体，且与ro-i蛋 白特异性结合，而与蛋白芯片上近10000种其他蛋白无交叉反应，显著提高了ro-ι蛋白免 疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各种肿瘤组织及其微环境中ro-i的检测。
[0023] 生物保藏信息说明
[0024] UMAB199,分类命名为程序性死亡分子1 (PD-1)单克隆抗体杂交瘤细胞株，于2015 年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCN0 :11085。
【附图说明】
[0025] 图1所示为实施例1中克隆位点图；
[0026] 图2所示为实施例2中ro-Ι蛋白Westernblot检测结果图，以anti-DDK检测 Η)-1蛋白在HEK293T细胞中的表达，其中泳道L为转染空载体的HEK293T细胞裂解液为抗 原的检测结果、泳道R为转染PCMV6-PD-1质粒的HEK293T细胞裂解液抗原的检测结果；
[0027] 图3所示为实施例2中ro-Ι蛋白SDS-PAGE结果图；
[0028] 图4所示实施例4肺癌淋巴细胞浸润组织免疫组化检测结果图（一抗为UMAB199 分泌产生的Η)-1单抗，1:500);
[0029] 图5所示实施例4淋巴瘤组织免疫组化检测结果图（一抗为UMAB199分泌产生的 PD-1 单抗，1:500);
[0030] 图6所示实施例4淋巴结组织免疫组化检测结果图（一抗为UMAB199分泌产生的 PD-1 单抗，1:500);
[0031] 图7所示实施例4扁桃体组织免疫组化检测结果图（一抗为UMAB199分泌产生的 PD-1 单抗，1:500);
[0032] 图8所示实施例5origene蛋白芯片鉴定结果图（一抗为UMAB199分泌产生的Η)-1 单抗，1:100 ;二抗为Alexa647-标记的驴抗鼠IgG，1:500)。
【具体实施方式】：
[0033] 本发明公开了抗ro-i蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗ro-i单克隆抗体 和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发 明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发 明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应 用本发明技术。
[0034] 下面就本发明提供的抗ro-i蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗ro-i单克 隆抗体和应用做进一步说明。
[0035] 实施例1 :ro-i重组表达质粒的构建
[0036] 以Origene公司Η)-1的cDNA克隆质粒SC117011为模板，设计两条引物并分别引 入酶切位点Sgfl和Mlul，克隆入表达载体pCMV6-Entry，建立Η)-1全长蛋白的重组真核表 达质粒。克隆位点设计如图1所示。
[0037] 实施例2 :ro-i重组蛋白的表达与纯化
[0038] 1、转染HEK293T细胞：HEK293T细胞以1:3传至培养皿中继续培养；取 7. 5mLDMEM(无血清及抗生素）至50mL管中，加入300yLPEIMegaTran1· 0混匀；加入 75μgΗ)-1重组质粒DNA至混匀液中，混匀并静置30分钟；分别取515μL至各培养皿中于 37°C5%C02培养箱中培养。转染24小时后，每皿细胞添加25μL2M丁酸钠至终浓度5mM。
[0039] 2、裂解细胞：转染48小时后，进行细胞裂解。吸去培养基，加入lmLPBS进行漂洗， 吸去PBS。加入lmL裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂PI和PMSF。置于冰盒中在摇床 上振荡，收集所有培养皿中得裂解液，4度离心，收集上清。
[0040] 3、DDK亲和层析柱纯化：以0. 45μM，33mmPVDF膜滤器过滤离心后的裂解液上清 并转入15mL管，加入混合好的BeadslmL，封口后放入360度混匀器中，于4°C结合2小时； 取出15mL管，将裂解液倒入BIO-RAD层析柱中，并接住穿透液，滴尽后穿透液取样WB检测， 见图2 ;以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次，滴尽后再用TBST冲洗Beads3次，滴尽后用0. 1M GlycinepH3. 5洗脱，第一次200μL，滴尽不收集，第二、三次各500μL，第三次250μL，收 集至一个1. 5mLTube中，并迅速加入NaH2P04(pH= 11. 0)中和至ρΗ7. 0左右，每管加入甘 油至终浓度为10%，Tween-80至终浓度为0. 1%。纯化后的Η)-1蛋白用SDS-PAGE鉴定， 见图3。
[0041 ] 由图2结果可见，标签抗体anti-DDK能检测到转染p